Aristóteles enseñó a Alejandro (356-323 a.C.) antes de que el príncipe heredara el trono de Macedonia en el 336 a.C. y comenzara a extender el imperio que su padre había ganado por conquista. Más tarde, el jardín del Liceo de Atenas llegó a contener plantas aportadas por los seguidores de los ejércitos de Alejandro. Teofrasto basó muchas de sus descripciones de plantas en relatos que obtuvo de viajeros que habían visitado regiones lejanas del imperio de Alejandro. La biblioteca de Alejandría, que probablemente utilizó Dioscórides, se abrió durante el reinado del general de Alejandro, Ptolomeo I Soter (ca. 367 a.C.-ca. 283 a.C.). Ptolomeo I era un amigo personal de Alejandro y puede haber sido un compañero de estudios de Aristóteles. Se convirtió en gobernante de Egipto en el 323 a.C. tras la muerte de Alejandro. El trabajo real de planificación y supervisión de la biblioteca se delegó en Demetrio de Falerón (ca. 350-ca. 280 a.C.), un estudiante del Liceo de Teofrasto.
Alejandro gobernó Macedón como regente desde el año 340 a.C., mientras su padre, Filipo II, dirigía un gran ejército macedonio que invadió Tracia, el país que limitaba con Macedón en el este. Más tarde, Alejandro se peleó con Filipo y abandonó Macedonia, pero en el 336 a.C. Filipo fue asesinado y Alejandro, con 20 años, se convirtió en Alejandro III de Macedonia, más tarde llamado Alejandro Magno. Al difundirse la noticia de la muerte de Filipo, los habitantes de los países conquistados por los macedonios vieron la oportunidad de conquistar su libertad, y Alejandro tuvo que actuar. Comenzó ejecutando a todos sus oponentes dentro de Macedonia, y luego restauró el dominio macedonio en Grecia, Tracia e Iliria.
Dejando al experimentado general Antípatro (ca. 398-319 a.C.) para que mantuviera el orden en casa, en el 334 a.C. Alejandro dirigió una gran fuerza hacia Asia Menor como primera etapa de su expansión imperial. Los macedonios derrotaron a un gran ejército persa, aseguraron la costa de Asia Menor y, en el 333 a.C., lucharon y derrotaron a otro ejército persa, éste dirigido por el rey persa Darío III. Las fuerzas de Alejandro se abrieron paso hacia el sur a través de Siria y Fenicia. En la primavera del 331 a.C., los macedonios entraron en Egipto. Al cabo de unos meses regresaron a Tiro, donde recibieron refuerzos de Europa y se dirigieron hacia el este. Derrotaron a los persas una vez más en Gaugemala, al este del río Tigris, ocuparon Babilonia y luego capturaron Susa y la capital persa, Persépolis, y Alejandro fue proclamado rey de Asia. Los macedonios reanudaron entonces la persecución de Darío, al que encontraron moribundo por las heridas infligidas por uno de sus propios nobles, que posteriormente fue capturado por los macedonios y castigado por orden de Alejandro. Presionando hacia el este en Asia central, llegaron a las montañas Tian Shan en el oeste de China, donde se ha encontrado una estatuilla de un soldado griego en un lugar de enterramiento.
En el año 326 a.C. Alejandro invitó a los jefes de lo que hoy es el norte de Pakistán a someterse a su gobierno. Algunos aceptaron, pero otros se opusieron a los macedonios y sólo fueron vencidos tras intensos combates en los que Alejandro resultó herido. Los soldados macedonios, que ansiaban ver sus hogares y familias, se opusieron al plan de Alejandro de adentrarse más en la India y le convencieron de que diera marcha atrás. Llegaron a Babilonia, donde Alejandro murió el 11 de junio de 323 a.C. en el palacio de Nabucodonosor II. Los historiadores no están seguros de la causa de su muerte, pero lo más probable es que fuera por enfermedad. En un mes más, Alejandro habría cumplido 33 años. Como muestra el siguiente mapa, en su apogeo su imperio se extendía desde Macedonia en el oeste hasta el valle del Indo en el este, y desde las orillas meridionales de los mares Negro y Caspio hasta Egipto. El imperio comenzó a desintegrarse a los pocos años de la muerte de Alejandro, dividiéndose en muchos reinos independientes.
Alejandro había sido alumno de Aristóteles, y aunque la educación del joven fue interrumpida era muy inteligente y Aristóteles había ejercido una fuerte influencia en su desarrollo. Aristóteles animaba a todos sus alumnos a observar e investigar el mundo natural, y Alejandro estaba muy interesado en las plantas y los animales. Un gran séquito de eruditos le acompañaba cuando dirigía sus ejércitos. Medían las distancias, preparaban mapas, estudiaban las religiones desconocidas y también la flora y la fauna. Cuando encontraban especies vegetales o animales desconocidas, Alejandro enviaba especímenes a Europa, muchos de ellos al Liceo de Atenas, para que los estudiara el propio Aristóteles. Recopiló la información que pudo sobre los tratamientos locales a base de hierbas y practicó la medicina, tratando personalmente algunas de las heridas y enfermedades que aquejaban a sus soldados.
En el año 332 a.C. Alejandro fundó la ciudad de Alejandría en el emplazamiento de Rhakotis, un puerto pesquero egipcio. Pretendía que la ciudad sirviera de puente entre las culturas de Grecia y Egipto, pero sólo permaneció allí unos meses después de iniciada la construcción, y nunca regresó. Tras la muerte de Alejandro, Ptolomeo I consiguió que su cuerpo fuera llevado a la ciudad. La biblioteca de Alejandría se construyó como una réplica del Liceo, con un paseo de columnas y jardines. Había salas de conferencias, salas de lectura y un comedor común, y la biblioteca estaba situada al lado y al servicio del Musaeum, que era un templo utilizado como institución académica -y el origen de la palabra museo-. Los responsables de la biblioteca tenían instrucciones de recopilar toda la información del mundo. Los representantes de la biblioteca acudían a las ferias de libros de Atenas y Rodas, y cada vez que un barco llegaba al puerto se incautaban los libros que llevaba y se copiaban, quedándose la biblioteca con los originales y devolviendo las copias al armador. Esta es la biblioteca en la que podría haber estudiado Pedanius Dioscorides. Gran parte de la biblioteca se quemó accidentalmente en el año 48 a.C. durante una guerra civil, y aunque una rama de la biblioteca, conocida como la biblioteca hija, siguió funcionando al sur de la ciudad, también fue destruida en el año 391 a.C. cuando el emperador romano Teodosio I (347-395) ordenó la destrucción de todos los templos paganos.