Abstract
Antecedentes. La amiloidosis es una precipitación extracelular de material hialino eosinofílico de origen propio con características especiales de tinción y ultraestructura fibrilar. La amiloidosis macular se limita a la piel y se han propuesto varios factores para su patogénesis. La detección de ADN del virus de Epstein-Barr (VEB) en esta lesión sugiere que este virus puede desempeñar un papel en la patogénesis de esta enfermedad. Objetivo. La detección del ADN del VEB se realizó en 30 muestras de piel con diagnóstico de amiloidosis macular y en 31 muestras de piel sana en el margen de nevos melanocíticos extirpados mediante PCR. Resultados. En los pacientes positivos para el gen de la beta-globina en la PCR, el gen BLLF1 del virus EBV fue positivo en 23 pacientes (8 pacientes en el grupo de casos y 15 pacientes en el grupo de control). No hubo diferencias significativas en la presencia de ADN del VEB entre los grupos de amiloidosis macular (3,8%) y de control (23,8%) (). Conclusión. Los resultados de este estudio mostraron que el VEB no está implicado en la patogénesis de la amiloidosis macular.
1. Introducción
La amiloidosis es el depósito extracelular de un grupo de proteínas fibrosas. Existe una variedad de enfoques para la clasificación de la amiloidosis, pero el método más sencillo es la división en tipos sistémicos y específicos de órganos (localizados). La piel es un tejido implicado en ambos tipos. La amiloidosis cutánea localizada es de dos tipos: (i) queratínica, que puede ser primaria o secundaria, y (ii) nodular. El tipo secundario es secundario a otras lesiones cutáneas como los tumores de la piel, los trastornos inflamatorios de la piel y la fototerapia. Se han identificado dos tipos de amiloidosis queratósica: la amiloidosis macular y la amiloidosis liquenoide, y esta última es más frecuente. En la amiloidosis queratósica, los depósitos de queratina que se originan en los queratinocitos basales son principalmente CK5 positivos. El tipo queratósico se observa sobre todo en el sudeste asiático, Sudamérica y China. Tiene formas familiares (10%) y esporádicas, y esta última es más común en las mujeres . Las localizaciones más comunes de afectación son la parte superior de la espalda (zona interescapular) y las extremidades (espinillas y brazos), aunque también se han descrito en la cara, el tronco y los muslos . Las lesiones de amiloidosis macular suelen aparecer en forma de manchas hiperpigmentadas con márgenes indefinidos compuestas por máculas de color marrón grisáceo, a menudo con un aspecto reticulado u ondulado (Figura 1). El prurito es un síntoma común antes de la aparición de la amiloidosis.
La patogénesis de este trastorno no está del todo dilucidada, salvo por el hecho de que la queratina depositada deriva de los queratinocitos . Se han propuesto dos mecanismos patogénicos que incluyen la teoría apoptótica (fibrilar) y la teoría secretora . Según la teoría apoptótica, a la degeneración de los queratinocitos dañados en la capa basal le sigue la conversión de estos cuerpos coloides por parte de los histiocitos y fibroblastos dérmicos en amiloide en la dermis papilar (Figura 2). Según la teoría de la secreción, los depósitos de amiloide derivados de los queratinocitos basales degenerados se extienden a la dermis papilar a través de la lámina densa dañada. Hay varios factores etiológicos implicados en la patogénesis de la amiloidosis macular: factores raciales, predisposición genética, factores ambientales, sexo (femenino), hormonas femeninas, exposición a la luz solar, fricción (abrasión de larga duración), atopia, autoinmunidad (basada en la asociación con el lupus eritematoso sistémico, la dermatomiositis, la esclerosis sistémica, la sarcoidosis y la nefropatía IgA) y la infección por el VEB. Es probable que el VEB, cuya presencia se ha notificado en la epidermis de la amiloidosis macular, actúe como factor que contribuye a la degeneración de los queratinocitos.
El papel del VEB en la etiopatogenia de la amiloidosis cutánea primaria sólo se ha evaluado en dos estudios previos, incluyendo un único informe de caso y una serie de casos de 27 pacientes de China . Teniendo en cuenta la escasez de estudios sobre la asociación entre el VEB y la amiloidosis macular, nos propusimos realizar un estudio al respecto en Irán. Tal vez se puedan utilizar en el futuro agentes antivirales para el tratamiento de esta enfermedad en caso de asociación con el VEB.
2. Materiales y métodos
En este estudio de casos y controles, se incluyeron 38 muestras de amiloidosis macular y 38 muestras de piel sana alrededor de nevos melanocíticos extirpados de pacientes emparejados por edad y sexo sin amiloidosis macular en el examen clínico basado en un muestreo orientado a objetivos no aleatorio. Los criterios de inclusión incluyeron bloques de parafina con suficiente tejido en los archivos del Departamento de Patología del Hospital Imam Reza de Mashhad con diagnóstico de amiloidosis macular basado en el informe patológico y la presentación clínica. Los criterios de exclusión incluían bloques con datos imperfectos en los archivos y muestras insuficientes para la PCR.
En el grupo de casos, la deposición amiloide se confirmó mediante microscopía óptica y tinción con rojo Congo. En el siguiente paso, se prepararon seis secciones de 5 μm de cada uno de los bloques de los grupos de casos y controles en condiciones estériles utilizando una cuchilla estéril y se colocaron en tubos Eppendorf estériles.
2.1. Se utilizó xilol/etanol para desparafinar los tejidos parafinados. Se añadió un mL de xilol a los microtubos que contenían secciones de tejido y se incubó a temperatura ambiente durante media hora con agitación constante. En el siguiente paso, se centrifugaron los microtubos a 13.000 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Estos dos pasos se repitieron una vez. Se añadieron 500 μL de etanol al 100% al precipitado y se centrifugó durante 10 m en 13.000 rpm tras varias inversiones del microtubo, y se eliminó el sobrenadante. Este paso se repitió de nuevo. Finalmente, el precipitado resultante se puso a temperatura ambiente para evaporar completamente el etanol pero no el precipitado.
2.2. Extracción de ADN
La extracción de ADN se realizó utilizando el kit de BIO BASIC INC (Canadá) con número de lote 8401-140116. Se utilizó el tampón de lisis-T para la extracción. En el siguiente paso, se añadieron 100 μL de tampón de extracción y 10 μL de proteinasa K a cada microtubo y se mezclaron. Las muestras de tejido se añadieron a la mezcla y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, las muestras se incubaron a 95 °C durante 3 minutos para inactivar la proteinasa K. Se añadieron 100 μL de tampón universal NST a los tubos y se invirtieron 10 veces. La mezcla obtenida se utilizó para la PCR.
2.3. PCR
En este estudio, se utilizó la PCR para detectar la presencia del genoma del VEB en la amiloidosis macular. Tras la extracción de ADN de bloques parafinados, se determinó la calidad del ADN extraído de los tejidos embebidos en parafina utilizando cebadores del gen de la beta-globina. Los cebadores del gen de la beta-globina GH20 y PC04 utilizados en este estudio amplificaron un fragmento de 260 pb. La secuencia de estos cebadores fue la siguiente GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.Las muestras que produjeron el fragmento de 260 pb utilizando los cebadores deseados se consideraron favorables para la amplificación del gen BLLF1 del virus EBV.
La presencia de la secuencia del EBV en las muestras de ADN extraídas se analizó utilizando el kit Cinna Gen con número de lote 935701 (Sina Clon, Irán). Este kit ha sido diseñado para determinar la calidad del ADN del VEB en muestras infectadas mediante PCR. El reactivo utilizado para la mezcla fue 1x PCR optimizado como una mezcla de Taq ADN polimerasa recombinante, tampón PCR, MgCl2, dNTPs y cebadores. La región altamente específica y repetitiva del gen BLLF1 que codifica la gp 350/220 es amplificada por los cebadores. Estos pueden detectar al menos 30 copias del VEB. La presencia de fragmentos de 239 pb o 256 pb indica un resultado positivo de la prueba.
El análisis de los datos se realizó con el software SPSS 11.5. Se utilizaron gráficos y tablas estadísticas para describir los datos y se emplearon pruebas de Chi-cuadrado e independientes para comparar el VEB en muestras sanas y de pacientes. En todas las pruebas se consideró el nivel de significación de 0,05.
3. Resultados
El 50% de los pacientes eran hombres (19/38) y el 50% mujeres (19/38). Tres pacientes pertenecían al grupo de edad de menos de 20 años (7,9%), 5 pacientes de 20 a 30 años (13,2%), 10 pacientes de 30 a 40 años (26,3%), 13 pacientes de 40 a 50 años (34,2%), 4 pacientes de 50 a 60 años (10,5%) y 3 pacientes de más de 60 años (7,9%). Las edades mínima y máxima fueron 19 y 76 años, respectivamente. Hubo 27 casos de infección en el tronco (71,1%) y 11 casos en las extremidades (28,9%). El grupo de estudio y el de control estaban emparejados por edad () y sexo ().
Se realizó una PCR para el gen de la beta-globina en 76 muestras (38 casos y 38 controles), que fue positiva en 61 muestras (30 muestras en el grupo de casos y 31 en el grupo de control) y fue negativa en 15 muestras (8 muestras en el grupo de casos y 7 en el grupo de control) (Figura 3).
En 61 muestras positivas para el gen de la beta-globina en la PCR, el gen BLLF1 del VEB fue positivo en 23 casos (8 casos en el grupo de estudio y 15 casos en el grupo de control) y fue negativo en 38 casos (22 casos en el grupo de estudio y 16 casos en el grupo de control) (Figura 4).
La PCR del gen BLLF1 del VEB fue positiva en un 26,7% en el grupo de estudio y en un 48,4% en el grupo de control. Los resultados de la prueba de Chi-cuadrado no mostraron ninguna correlación entre el VEB y la amiloidosis macular () (Tabla 1).
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4. Discusión
La amiloidosis se conoce como una deposición extracelular de material hialino eosinofílico de origen propio con tinción y características ultraestructurales específicas. Este trastorno puede ocurrir en el fondo de enfermedades sistémicas o puede limitarse a la piel. La amiloidosis macular se limita a la piel. El VEB puede estimular la secreción de material amiloide por parte de los queratinocitos o puede ser un estímulo para la degeneración de los queratinocitos y la conversión de los filamentos degenerados de los queratinocitos en amiloide . Estudios recientes han indicado el papel de las células epiteliales en la reproducción continua del VEB. Los receptores de la superficie celular del VEB encontrados en el epitelio escamoso menos diferenciado sugieren la infección directa de los queratinocitos epidérmicos. La infección puede producirse en las capas germinativas; sin embargo, la replicación del virus sólo es posible a través de la maduración y diferenciación de las células. La expresión de la citoqueratina en los queratinocitos humanos se modifica in vitro tras la infección con el VEB, lo que provoca su conversión en fibroblastos . Los fibroblastos pueden fagocitar agregados de queratina y convertirlos en amiloide.
Drago et al. mostraron esta correlación en Italia en 1996. Su paciente era una mujer de 30 años con una historia de diez años de pápulas y máculas marrones pruriginosas en el pecho y la espalda con síntomas de síndrome de fatiga crónica. Pudieron mostrar el genoma del VEB en las lesiones epidérmicas utilizando la técnica de hibridación in situ. El genoma del VEB se mostró principalmente en las células epidérmicas basales, así como en las células de la capa superior, especialmente en el citoplasma. Las pruebas serológicas para el VEB también fueron positivas en la paciente. El tratamiento antiviral con aciclovir e interferón alfa mejoró las lesiones cutáneas y los síntomas generales de la paciente. Otro estudio fue realizado por Chang et al. en tejido cutáneo de 27 pacientes con diagnóstico de liquen y amiloidosis macular en Taiwán en 1997. El método de hibridación in situ indicó la presencia de ADN del VEB en las lesiones de 11 pacientes (40,7%), mientras que el grupo de control (que incluía tres pacientes con amiloidosis cutánea secundaria, dos pacientes con amiloidosis sistémica primaria y cuatro pacientes con liquen simple crónico) carecía de ADN del VEB.
Según este estudio, no había correlación entre el VEB y la amiloidosis macular (). El ADN del VEB estaba presente en 8 pacientes con amiloidosis macular y 15 controles en nuestro estudio. La diferencia en la tasa de detección del ADN del VEB entre los pacientes con amiloidosis macular y los controles en este estudio con los estudios mencionados puede deberse a las siguientes razones:(1)Falta de asociación entre la amiloidosis macular y la infección por el VEB: hay unos pocos estudios que presentan pruebas insuficientes para una correlación definitiva entre el VEB y la amiloidosis macular, por lo que basándonos en los resultados de nuestro estudio podríamos llegar a esta conclusión.(2)Metodología (PCR frente a hibridación in situ): utilizamos un método sensible para la detección del ADN del VEB con controles positivos y negativos. Según los estudios anteriores, la PCR es tan sensible como la hibridación in situ. Sin embargo, como no utilizamos la hibridación in situ, no pudimos localizar la célula infectada exacta con el VEB en nuestros controles, que podrían ser las células B circulantes de la piel en lugar de los queratinocitos. Como utilizamos controles positivos y negativos en nuestro kit de PCR para el VEB, los casos positivos de nuestro grupo de control no podrían ser falsos positivos.(3)Controles: los controles de nuestro estudio fueron la piel sana alrededor de los nevos melanocíticos, pero los controles del estudio de Chang fueron otros trastornos cutáneos.(4)Tipo de amiloidosis cutánea: en nuestro estudio, todos los pacientes tenían amiloidosis macular, pero en los dos estudios anteriores la mayoría de los pacientes eran de amiloidosis liquenoide.
5. Conclusión
Según los resultados de este estudio, no hubo correlación entre el VEB y la amiloidosis macular. Recomendamos el uso de tejido fresco o punch de biopsia congelado rápidamente, así como el estudio serológico simultáneo de los pacientes para el anticuerpo anti-VEB para lograr resultados más precisos para el estudio comparativo del ADN del VEB en la amiloidosis macular. También se puede utilizar la PCR in situ para localizar las células positivas al ADN del VEB en las muestras. Se pueden utilizar otros genes para detectar el VEB en el tejido, ya que algunas muestras de VEB están mutadas para el gen BLLF1 utilizado en este estudio.
Además, recomendamos realizar un estudio comparativo sobre la detección del VEB en la piel implicada y no implicada de los pacientes con amiloidosis macular.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores expresan su profunda gratitud al adjunto de investigación de MUMS por el apoyo financiero y la aprobación de la propuesta de investigación (nº 911283) relacionada con la tesis de Narges Nazeri. Se agradece el apoyo financiero de la Universidad de Ciencias Médicas de Mashhad.