I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Reacción enzimática (la imagen se abrirá en una nueva ventana)

Chymotrypsin es una endopeptidasa de serina producida por las células acinares del páncreas. La quimotripsina se activa tras la proteólisis del quimotripsinógeno por la tripsina. Mientras que la tripsina hidroliza la lisina y la arginina, la quimotripsina escinde selectivamente los enlaces peptídicos formados por residuos aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptófano) (Hedstrom et al. 1992). Dos formas predominantes de quimotripsina, la A y la B, se encuentran en cantidades iguales en el páncreas del ganado. Son proteínas muy similares (80% idénticas), pero tienen características proteolíticas significativamente diferentes (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, y Gráf et al. 2004). La información que figura a continuación se refiere principalmente a la forma A del quimotripsinógeno y la quimotripsina.

Historia:

A principios del siglo XX, Vernon propuso que las preparaciones pancreáticas podían dar lugar a un activador intrínseco de sus propias enzimas (Vernon 1901). Los experimentos de Vernon sobre la coagulación de la leche determinaron que había al menos dos enzimas presentes y que una era más estable que la otra (Vernon 1902). Sin embargo, esta idea no fue ampliamente aceptada hasta 1934, cuando Kunitz y Northrop confirmaron la presencia de una enzima además de la tripsina, denominándola quimotripsina. Consiguieron cristalizar la quimotripsina, así como su precursor inactivo, el quimotripsinógeno (Kunitz y Northrop 1934). En 1938, Kunitz aisló diferentes formas activas de la quimotripsina, designándolas como alfa, beta y gamma (Kunitz 1938).

A principios de la década de 1940, Fruton y Bergmann siguieron estudiando la especificidad de la quimotripsina, informando sobre varios sustratos nuevos (Fruton y Bergmann 1942). Jacobsen pronto identificó formas adicionales de quimotripsina, designándolas como delta y pi (Jacobsen 1947). En 1948, Schwert caracterizó aún más los pesos moleculares de la quimotripsina y del quimotripsinógeno.

En 1954, la primera evidencia del mecanismo de tres pasos de la quimotripsina que hidroliza sustratos de amida y éster fue reportada por Hartley y Kilby, quienes hipotetizaron la presencia de un intermedio enzimático de acil, lo que posteriormente se demostró que era cierto (Henderson 1970). En 1955, Laskowski obtuvo un segundo quimotripsinógeno cristalino, denominándolo quimotripsinógeno B. En 1964, Hartley determinó la secuencia de aminoácidos de la quimotripsina A, que posteriormente fue refinada por Meloun et al. en 1966. En 1968, Smillie et al. determinaron la secuencia de aminoácidos de la quimotripsina B, que reveló una identidad de secuencia del 80% con la quimotripsina A. A lo largo de las décadas de 1970 y 1980 se realizaron investigaciones para comprender mejor el mecanismo de acción e identificar las diferencias en las secuencias de aminoácidos entre la tripsina y la quimotripsina (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth y Polgár 1983, y Gráf et al. 1988).

En la década de 1990, la quimotripsina se purificó a partir de otras fuentes, incluyendo el bacalao del Atlántico (Ásgeirsson y Bjarnason 1991), y el camello (Al-Ajlan y Bailey 1997). También se comenzó a investigar los inhibidores (Baek et al. 1990), y Frigerio et al. dilucidaron la estructura cristalina de la quimotripsina bovina a una resolución de 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Investigaciones recientes han estudiado el plegamiento y la desnaturalización de la quimotripsina en un rango de concentraciones (Ghaouar et al. 2010), la interacción de la quimotripsina con sustratos de nanopartículas (You et al. 2006, y Jordan et al. 2009), y el aumento de la estabilidad de la quimotripsina mediante la conjugación con moléculas de PEG (Castellanos et al. 2005, y Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Especificidad:

La quimotripsina se activa a través de la escisión del enlace entre la arginina y la isoleucina (R15 e I16) por parte de la tripsina, provocando modificaciones estructurales y la formación del sitio de unión al sustrato (Sears 2010). La quimotripsina difiere de la tripsina en que ésta escinde los péptidos en los residuos de arginina y lisina, mientras que la quimotripsina prefiere los residuos hidrofóbicos grandes (Hedstrom et al. 1992). La quimotripsina cataliza preferentemente la hidrólisis de los enlaces peptídicos que implican isómeros L de tirosina, fenilalanina y triptófano. También actúa fácilmente sobre amidas y ésteres de aminoácidos susceptibles. La especificidad de la quimotripsina para los residuos hidrofóbicos grandes puede explicarse por una bolsa de unión hidrofóbica S1 formada por los residuos 189 a 195, 214 a 220, y 225 a 228 (Cohen et al. 1981).

Aunque la estructura del sitio S1 de la tripsina y de la quimotripsina muestran sólo una diferencia (en la posición 189), la mutagénesis dirigida al sitio de la tripsina y de la quimotripsina no ha logrado intercambiar las especificidades, lo que sugiere que el mecanismo por el que la tripsina y la quimotripsina logran la catálisis específica del sustrato no se entiende completamente (Steitz et al. 1969, y Gráf et al. 1988).

Características moleculares:

La quimotripsina A y B comparten un 80% de identidad de secuencia (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, y Gráf et al. 2004). Los aminoácidos de la tríada catalítica (H57, D102 y S195) están muy conservados en las secuencias de las peptidasas de la familia S1 (Gráf et al. 2004). La serina en la posición 214 también está muy conservada en la familia y se ha propuesto como el cuarto miembro de la tríada catalítica (Ohara et al. 1989, y McGrath et al. 1992).

Composición:

Los tres residuos de aminoácidos de la tríada catalítica (H57, D102, y S195) son esenciales para la escisión del enlace peptídico y se estabilizan mediante enlaces de hidrógeno (Sears 2010, y Gráf et al. 2004). G193 y S195 conforman el hueco del oxianión e interactúan con el grupo carbonilo del enlace peptídico sísilico, orientándolo para formar el intermedio tetraédrico (Rühlmann et al. 1973, Huber y Bode 1978, y Gráf et al. 2004).

Número de acceso a la proteína: P00766

Clasificación CATH (v. 3.3.0):

• Clase: Principalmente Beta
• Arquitectura: Barril Beta
• Topología: Proteasa de serina similar a la tripsina

Peso molecular:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

PH óptimo: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Punto isoeléctrico:

• 8.52 (quimotripsinógeno, teórico)
• 8,33 (quimotripsina, teórico)

Coeficiente de extinción:

• 51,840 cm-1 M-1 (teórico)
• E1%,280 = 20.19 (Quimotripsinógeno, teórico)
• E1%,280 = 20.57 (Quimotripsina, teórica)

Residuos del sitio activo:

• Histidina (H57)
• Aspartato (D102)
• Serina (S195)

Activadores:

• Bromuro de cetiltilamonio (Spreti et al. 2008)
• Bromuro de dodeciltrimetilamonio (Abuin et al. 2005)
• Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Celej et al. 2004)
• Bromuro de tetrabutilamonio (Spreti et al. 2001)

Inhibidores:

• Hidroximetilpirroles (Abell y Nabbs 2001)
• Ácidos borónicos (Smoum et al. 2003)
• Derivados de la cumarina (Pochet et al. 2000)
• Peptidil aldehídos (Lesner et al. 2009)
• Péptidos de fuentes naturales (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, y Chopin et al. 2000)
• Péptidos que contienen un aminoácido no natural (Legowska et al. 2009, y Wysocka et al. 2008)

Aplicaciones:

• Análisis de secuencias
• Síntesis de péptidos
• Mapeo de péptidos
• Huellas digitales de péptidos