La clonación molecular es un conjunto de técnicas utilizadas para insertar ADN recombinante de una fuente procariota o eucariota en un vehículo de replicación como plásmidos o vectores virales. La clonación consiste en hacer numerosas copias de un fragmento de ADN de interés, como un gen. En este vídeo aprenderá los diferentes pasos de la clonación molecular, cómo configurar el procedimiento y las diferentes aplicaciones de esta técnica.
Antes de comenzar la clonación se necesitan al menos dos moléculas de ADN importantes. En primer lugar, y lo más importante, se necesita el fragmento de ADN que se va a clonar, también conocido como inserto. Puede proceder de un procariota, de un eucariota, de un organismo extinto o puede crearse artificialmente en el laboratorio. Utilizando la clonación molecular podemos aprender más sobre la función de un gen en particular.
En segundo lugar, se necesita un vector. Un vector es un ADN plasmídico que se utiliza como herramienta en biología molecular para hacer más copias o producir una proteína de un determinado gen. Los plásmidos son un ejemplo de vector, y son ADN circular, extracromosómico, que es replicado por las bacterias.
Un plásmido suele tener un sitio de clonación múltiple o MCS, esta área contiene sitios de reconocimiento para diferentes endonucleasas de restricción también conocidas como enzimas de restricción. Se pueden incorporar diferentes insertos en el plásmido mediante una técnica llamada ligadura. El vector del plásmido también contiene un origen de replicación, que le permite replicarse en las bacterias. Además, el plásmido tiene un gen antibiótico. Si las bacterias incorporan el plásmido, sobrevivirán en medios que contengan el antibiótico. Esto permite seleccionar las bacterias que se han transformado con éxito.
El inserto y el vector se clonan en un organismo celular huésped, el más comúnmente utilizado en la clonación molecular es E. coli. E. coli crece rápidamente, está ampliamente disponible y tiene numerosos vectores de clonación diferentes producidos comercialmente. Los eucariotas, como la levadura, también pueden utilizarse como organismos anfitriones de los vectores.
El primer paso del procedimiento general de clonación molecular es obtener el inserto deseado, que puede derivarse de ADN o ARNm de cualquier tipo de célula. A continuación, se elige el vector óptimo y su organismo huésped en función del tipo de inserto y de lo que finalmente se hará con él. A menudo se utiliza un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, para replicar el inserto.
Después, mediante una serie de reacciones enzimáticas, el inserto y la digestión se unen y se introducen en el organismo huésped para su replicación masiva. Los vectores replicados se purifican de las bacterias y, tras la digestión de restricción, se analizan en un gel. Los fragmentos purificados en el gel se envían posteriormente para su secuenciación con el fin de verificar que el inserto es el fragmento de ADN deseado.
Veamos con más detalle cómo se lleva a cabo la clonación molecular. Antes de comenzar, querrá planificar su estrategia de clonación, antes de hacer cualquier intento de clonación en el banco. Por ejemplo, cualquier vector plasmídico dado, le proporcionará un número finito de sitios de restricción para incorporar el inserto a través del sitio de clonación múltiple. Tendrá que elegir sitios de restricción que no se encuentren en su inserto para no escindirlo. Puede que te encuentres en una situación en la que te veas obligado a unir un fragmento de extremo romo con otro que tenga un saliente. Si es así, entonces usar el fragmento klenow para establecer una ligadura de extremo romo podría ser su única opción para obtener el inserto en su vector deseado. El conocimiento de las distintas herramientas de clonación molecular que tiene a su disposición, así como la elaboración de una estrategia cuidadosa antes de comenzar la clonación, pueden ahorrarle mucho tiempo.
La fuente de ADN para la clonación molecular puede aislarse de casi cualquier tipo de muestra celular o de tejido mediante técnicas de extracción sencillas. Una vez aislado, se puede utilizar la PCR para amplificar el inserto.
Una vez amplificado el inserto, tanto éste como el vector son digeridos por enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas de restricción.
Una vez digeridos, el inserto y el vector pueden pasar por un gel y purificarse mediante un proceso denominado purificación en gel. Con respecto al vector, este paso ayudará a purificar el plásmido linealizado del plásmido sin cortar, que tiende a aparecer como una mancha de alto peso molecular en un gel.
Después de la purificación en gel de los digeridos, el inserto se liga o se une al plásmido, mediante una enzima llamada ADN ligasa.
En general, siempre es una buena idea establecer las ligaciones, de manera que la proporción entre el inserto y el vector sea de 3 a 1, lo que asegura que sólo una pequeña cantidad de vector se autoligará. Una vez que la ligación se ha establecido en hielo, se incuba en cualquier lugar de 14-25˚C desde 1 hora hasta toda la noche.
A continuación, se realiza la transformación para introducir el vector del plásmido en el huésped que lo replicará.
Después de la transformación, las bacterias se chapan en placas de agar con antibiótico y se incuban durante la noche a 37°C. Dado que el plasmímido contiene un gen de resistencia a los antibióticos, la transformación exitosa producirá colonias bacterianas cuando se cultiven en placas de agar en presencia de antibióticos. A continuación, las colonias individuales pueden recogerse de la placa transformada, colocarse en medios de cultivo líquidos en tubos numerados y colocarse en una incubadora con agitación para su expansión. Un pequeño volumen de cultivo líquido se añade a una placa de agar numerada, mientras que el resto del cultivo pasa a la purificación del plásmido. El esquema de numeración que denota la identidad de las colonias bacterianas de las que finalmente se purificarán los plásmidos se mantiene durante todo el proceso de purificación de plásmidos.
Una muestra de plásmido purificado se corta entonces con enzimas de restricción. La digestión se carga y se corre en el gel para comprobar la presencia del inserto, lo que verificará que la colonia bacteriana se transformó con un plásmido que contiene un inserto y no con un plásmido autoligado. Si se verifica que las bacterias se han transformado con un plásmido que contiene un inserto, se expanden para seguir purificando el plásmido. La secuenciación se realiza como paso final de verificación para confirmar que el gen de interés ha sido clonado.
La clonación molecular puede utilizarse para un número casi ilimitado de aplicaciones. Por ejemplo, cuando una plantilla de ARNm se transcribe de forma inversa para formar ADNc, o ADN complementario, mediante una enzima llamada transcriptasa inversa y luego se utiliza la PCR para amplificar el ADNc, la clonación molecular puede utilizarse para crear una biblioteca de ADNc, es decir, una biblioteca de todos los genes expresados por un tipo de célula determinado.
La clonación molecular también puede emplearse para tomar una serie de genes, o un grupo de genes de una cepa bacteriana, reorganizarlos en plásmidos que se transforman en otra cepa, por lo que se puede recrear toda una vía biosintética para producir una molécula compleja.
A través de la clonación molecular, se puede generar una biblioteca de mutantes expresando un plásmido objetivo en una cepa bacteriana especial que utiliza una polimerasa propensa a errores cuando se cultiva a determinadas temperaturas. Las mutaciones pueden caracterizarse mediante secuenciación. Las bacterias transformadas con genes mutantes pueden entonces probarse con diferentes fármacos o productos químicos para ver qué colonias bacterianas han evolucionado para tener resistencia a los fármacos.
Gracias a la clonación molecular, los genes informadores pueden incorporarse a los plásmidos de ADN, un gen informador común es la proteína verde fluorescente o GFP, que emite una fluorescencia verde cuando se expone a la luz UV. También se puede insertar un gen informador en un alfavirus para mostrar la infección en mosquitos y la transmisibilidad en células.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre clonación molecular. Ahora deberías entender cómo funciona la clonación molecular y cómo se puede utilizar esta técnica en biología molecular. Como siempre, ¡gracias por verlo!