Aristoteles učil Alexandra (356-323 př. n. l.) ještě předtím, než tento princ v roce 336 př. n. l. zdědil makedonský trůn a začal rozšiřovat říši, kterou jeho otec získal výboji. Později se v zahradě u athénského lycea začaly pěstovat rostliny, kterými přispěli stoupenci Alexandrových vojsk. Theofrastos založil mnoho svých popisů rostlin na zprávách, které získal od cestovatelů, kteří navštívili vzdálené oblasti Alexandrovy říše. Knihovna v Alexandrii, kterou Dioskoridés pravděpodobně využíval, byla otevřena za vlády Alexandrova generála Ptolemaia I. Sotera (asi 367 př. n. l. – asi 283 př. n. l.). Ptolemaios I. byl blízkým osobním přítelem Alexandra a mohl být jeho spolužákem, kterého učil Aristoteles. V roce 323 př. n. l. se po Alexandrově smrti stal vládcem Egypta. Vlastní prací na plánování a dohledu nad knihovnou byl pověřen Démétrios z Faleronu (asi 350 – asi 280 př. n. l.), Theofrastův student z lycea.
Alexandr vládl Makedonii jako regent od roku 340 př. n. l., zatímco jeho otec Filip II. vedl velké makedonské vojsko, které vtrhlo do Thrákie, země sousedící s Makedonií na východě. Později se Alexandr s Filipem pohádal a Makedonii opustil, ale v roce 336 př. n. l. byl Filip zavražděn a dvacetiletý Alexandr se stal Alexandrem III. makedonským, později zvaným Alexandr Veliký. Jakmile se zpráva o Filipově smrti rozšířila, lidé v zemích dobytých Makedonci spatřili šanci chopit se svobody a Alexandr musel jednat. Začal popravou všech svých odpůrců uvnitř Makedonie a poté obnovil makedonskou vládu v Řecku, Thrákii a Ilýrii.
Alexandr nechal zkušeného generála Antipatera (asi 398-319 př. n. l.), aby udržoval pořádek doma, a v roce 334 př. n. l. vedl velké vojsko do Malé Asie jako první etapu své císařské expanze. Makedonci porazili velkou perskou armádu, zajistili pobřeží Malé Asie a v roce 333 př. n. l. bojovali a porazili další perskou armádu, tentokrát vedenou perským králem Dareiem III. Alexandrova vojska se poté probojovala na jih přes Sýrii a Fénicii. Na jaře roku 331 př. n. l. vstoupili Makedonci do Egypta. Po několika měsících se vrátili do Týru, kde obdrželi posily z Evropy, a zamířili na východ. Znovu porazili Peršany u Gaugemaly na východ od řeky Tigris, obsadili Babylon, poté se zmocnili Sús a perského hlavního města Persepole a Alexandr byl prohlášen králem Asie. Makedonci poté pokračovali v pronásledování Dareia, kterého našli umírajícího na následky zranění, jež mu způsobil jeden z jeho vlastních šlechticů – ten byl později Makedonci zajat a na Alexandrův rozkaz potrestán. Tlačili na východ do střední Asie a dostali se až do pohoří Tian Shan v západní Číně, kde byla na pohřebišti nalezena soška řeckého vojáka.
V roce 326 př. n. l. vyzval Alexandr náčelníky z dnešního severního Pákistánu, aby se podřídili jeho vládě. Někteří souhlasili, ale jiní se Makedoncům postavili na odpor a byli přemoženi až po intenzivních bojích, v nichž byl Alexandr zraněn. Makedonští vojáci, kteří toužili vidět své domovy a rodiny, se postavili proti Alexandrovu plánu proniknout dále do Indie a přesvědčili ho, aby se vrátil. Dorazili do Babylonu, kde Alexandr 11. června 323 př. n. l. zemřel v paláci Nabuchodonozora II. Historikové si nejsou jisti příčinou jeho smrti, ale nejpravděpodobnější je, že zemřel na nemoc. Za další měsíc by Alexandrovi bylo 33 let. Jak ukazuje následující mapa, v době svého největšího rozkvětu sahala jeho říše od Makedonie na západě až po údolí Indu na východě a od jižních břehů Černého a Kaspického moře až po Egypt. Během několika let po Alexandrově smrti se říše začala rozpadat a rozpadla se na mnoho nezávislých království.
Alexandr byl Aristotelovým žákem, a přestože vzdělání mladého muže bylo přerušeno, byl vysoce inteligentní a Aristoteles měl na jeho vývoj silný vliv. Aristoteles povzbuzoval všechny své studenty, aby pozorovali a zkoumali svět přírody, a Alexandr se živě zajímal o rostliny a zvířata. Když vedl svá vojska, doprovázela ho početná družina učenců. Měřili vzdálenosti, připravovali mapy, studovali neznámá náboženství a také flóru a faunu. Když narazili na neznámé rostlinné nebo živočišné druhy, Alexandr posílal exempláře zpět do Evropy, mnohé z nich do lycea v Athénách, aby se jimi zabýval sám Aristoteles. Shromáždil veškeré informace o místní bylinné léčbě a praktikoval lékařství, přičemž osobně léčil některá zranění a nemoci, které trápily jeho vojáky.
V roce 332 př. n. l. založil Alexandr na místě egyptského rybářského přístavu Rhakotis město Alexandrii. Jeho záměrem bylo, aby město propojilo řeckou a egyptskou kulturu, ale po zahájení stavby se zde zdržel jen několik měsíců a už se nevrátil. Po Alexandrově smrti se Ptolemaiovi I. podařilo nechat do města přivézt jeho tělo. Alexandrijská knihovna byla postavena jako replika lycea s kolonádou a zahradami. Byly zde přednáškové sály, čítárny a společná jídelna a knihovna se nacházela vedle Musaeum, což byl chrám sloužící jako akademická instituce – a odtud pochází slovo muzeum. Správci knihovny měli za úkol shromažďovat všechny informace na světě. Zástupci knihovny se účastnili knižních veletrhů v Athénách a na Rhodu, a kdykoli do přístavu připlula loď, všechny knihy, které vezla, byly zabaveny a okopírovány, přičemž knihovna si ponechala originály a kopie vrátila veliteli lodi. V této knihovně možná studoval Pedanius Dioscorides. Velká část knihovny byla nešťastnou náhodou vypálena v roce 48 př. n. l. během občanské války, a přestože na jihu města nadále fungovala pobočka knihovny, známá jako dceřiná knihovna, i ta byla v roce 391 n. l. zničena, když římský císař Theodosius I. (347-395) nařídil zničit všechny pohanské chrámy.