I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Enzymatická reakce (obrázek se otevře v novém okně)

Chymotrypsin je serinová endopeptidáza produkovaná acinárními buňkami pankreatu. Chymotrypsin se aktivuje po proteolýze chymotrypsinogenu trypsinem. Zatímco trypsin hydrolyzuje na lysin a arginin, chymotrypsin selektivně štěpí peptidové vazby tvořené aromatickými zbytky (tyrosin, fenylalanin a tryptofan) (Hedstrom et al. 1992). Ve slinivce břišní skotu se vyskytují dvě převládající formy chymotrypsinu, A a B, ve stejném množství. Jsou to velmi podobné proteiny (z 80 % identické), ale mají výrazně odlišné proteolytické vlastnosti (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 a Gráf et al. 2004). Níže uvedené informace se týkají především formy A chymotrypsinogenu a chymotrypsinu.

Historie:

Na počátku 20. století Vernon navrhl, že pankreatické preparáty mohou dát vzniknout vnitřnímu aktivátoru vlastních enzymů (Vernon 1901). Vernonovy pokusy se srážením mléka určily, že jsou přítomny nejméně dva enzymy a že jeden je stabilnější než druhý (Vernon 1902). Tato myšlenka však nebyla široce přijata až do roku 1934, kdy Kunitz a Northrop potvrdili přítomnost dalšího enzymu kromě trypsinu a pojmenovali jej chymotrypsin. Podařilo se jim vykrystalizovat chymotrypsin i neaktivní prekurzor, chymotrypsinogen (Kunitz a Northrop 1934). V roce 1938 Kunitz izoloval různé aktivní formy chymotrypsinu a označil je jako alfa, beta a gama (Kunitz 1938).

Na počátku 40. let 20. století Fruton a Bergmann dále studovali specifičnost chymotrypsinu a podali zprávu o několika nových substrátech (Fruton a Bergmann 1942). Jacobsen brzy identifikoval další formy chymotrypsinu a označil je jako delta a pi (Jacobsen 1947). V roce 1948 Schwert dále charakterizoval molekulové hmotnosti chymotrypsinu a chymotrypsinogenu.

V roce 1954 podali Hartley a Kilby první důkaz o třístupňovém mechanismu chymotrypsinu hydrolyzujícího amidové a esterové substráty a vyslovili hypotézu o přítomnosti acylového enzymového meziproduktu, která se později ukázala jako pravdivá (Henderson 1970). V roce 1955 Laskowski získal druhý krystalický chymotrypsinogen a pojmenoval jej chymotrypsinogen B. V roce 1964 Hartley určil aminokyselinovou sekvenci chymotrypsinu A, kterou později upřesnili Meloun a kol. v roce 1966. V roce 1968 Smillie et al. určili aminokyselinovou sekvenci chymotrypsinu B, která odhalila 80% sekvenční identitu s chymotrypsinem A. V průběhu 70. a 80. let 20. století probíhal výzkum s cílem lépe pochopit mechanismus účinku a určit rozdíly v aminokyselinových sekvencích trypsinu a chymotrypsinu (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth a Polgár 1983 a Gráf et al. 1988).

V 90. letech 20. století byl chymotrypsin purifikován z dalších zdrojů, včetně tresky atlantské (Ásgeirsson a Bjarnason 1991) a velblouda (Al-Ajlan a Bailey 1997). Začalo se také pracovat na zkoumání inhibitorů (Baek a kol. 1990) a Frigerio a kol. objasnili krystalovou strukturu hovězího chymotrypsinu s rozlišením 2,0 Å (Frigerio a kol. 1992).

Nejnovější výzkum se zabýval skládáním a denaturací chymotrypsinu v různých koncentracích (Ghaouar a kol. 2010), interakcí chymotrypsinu s nanočásticovými substráty (You a kol. 2010), interakcí chymotrypsinu se substráty s nanočásticemi (You a kol. 2010) a interakcí chymotrypsinu se substráty s nanočásticemi (You a kol. 2010). 2006 a Jordan et al. 2009) a zvýšení stability chymotrypsinu konjugací s molekulami PEG (Castellanos et al. 2005 a Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Specifičnost:

Chymotrypsin je aktivován štěpením vazby mezi argininem a isoleucinem (R15 a I16) trypsinem, což způsobí strukturní modifikace a vytvoření vazebného místa pro substrát (Sears 2010). Chymotrypsin se od trypsinu liší tím, že trypsin štěpí peptidy na argininových a lyzinových zbytcích, zatímco chymotrypsin preferuje velké hydrofobní zbytky (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsin přednostně katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb zahrnujících L-izomery tyrosinu, fenylalaninu a tryptofanu. Snadno působí také na amidy a estery citlivých aminokyselin. Specifičnost chymotrypsinu pro velké hydrofobní zbytky lze vysvětlit hydrofobním vazebným pocketem S1 tvořeným zbytky 189 až 195, 214 až 220 a 225 až 228 (Cohen et al. 1981).

Ačkoli struktura S1 místa trypsinu a chymotrypsinu vykazuje pouze jeden rozdíl (v poloze 189), mutagenezí trypsinu a chymotrypsinu řízenou na místě se nepodařilo zaměnit specifity, což naznačuje, že mechanismus, kterým trypsin a chymotrypsin dosahují substrátově specifické katalýzy, není plně pochopen (Steitz et al. 1969 a Gráf et al. 1988).

Molekulární charakteristika:

Chymotrypsin A a B mají 80 % sekvenční identitu (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 a Gráf et al. 2004). Aminokyseliny katalytické triády (H57, D102 a S195) jsou vysoce konzervované v sekvencích peptidáz rodiny S1 (Gráf et al. 2004). Serin v poloze 214 je také vysoce konzervovaný v rodině a byl navržen jako čtvrtý člen katalytické triády (Ohara et al. 1989 a McGrath et al. 1992).

Složení:

Tři aminokyselinové zbytky katalytické triády (H57, D102 a S195) jsou nezbytné pro štěpení peptidové vazby a jsou stabilizovány vodíkovými vazbami (Sears 2010 a Gráf et al. 2004). G193 a S195 tvoří oxyaniontovou díru a interagují s karbonylovou skupinou štěpné peptidové vazby a orientují ji za vzniku tetraedrického meziproduktu (Rühlmann et al. 1973, Huber a Bode 1978 a Gráf et al. 2004).

Proteinové přístupové číslo: P00766

Klasifikace CATH (v. 3.3.0):

• Třída: P00766

  Klasifikace CATH (v. 3.3.0): Převážně Beta

• Architektura: Beta Barrel
• Topologie: Trypsinu podobná serinová proteáza

Molekulová hmotnost:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

Optimální pH: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Isoelektrický bod:

• 8.52 (chymotrypsinogen, teoretický)
• 8,33 (chymotrypsin, teoretický)

Extinkční koeficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (teoretický)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, teoretický)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, teoretický)

Zbytky aktivního místa:

• Histidin (H57)
• Aspartát (D102)
• Serin (S195)

Aktivátory:

• Cetyltributylamonium bromid (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylamonium bromid (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylamonium bromid (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylamonium bromid (Spreti et al. 2001)

Inhibitory:

• Hydroxymethylpyrroly (Abell a Nabbs 2001)
• Kyseliny boronové (Smoum et al. 2003)
• Deriváty kurmarinu (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehydy (Lesner et al. 2009)
• Peptidy z přírodních zdrojů (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001 a Chopin et al. 2000)
• Peptidy obsahující nepřirozenou aminokyselinu (Legowska et al. 2009 a Wysocka et al. 2008)

Použití:

• Sekvenční analýza
• Syntéza peptidů
• Mapování peptidů
• Otiskování peptidů

.