MYC amplifikace snižuje přežití u mnoha lidských malignit

Jedním z klíčových TF regulujících proliferaci savčích buněk je virový onkoprotein myelocytomatózy (MYC), jehož funkce je zachována napříč evolučními hierarchiemi27,28,29,30,31. Fyziologicky je proliferace regulovaná MYC vystřídána programy liniové diferenciace, které antagonizují MYC a ukončují proliferaci20. Změny MYC jsme analyzovali dvěma přístupy. Nejprve jsme analyzovali změny počtu kopií (CN) v lokusu MYC pomocí dat TCGA a ICGC dostupných prostřednictvím platformy cBioPortal a zjistili jsme časté amplifikace a zisky MYC (obr. 1a). Poté jsme získali přístup k celonádorovým datům TCGA (PANCAN) obsahujícím 11 000 pacientů u 33 nejčastějších nádorů a analyzovali je prostřednictvím prohlížeče Xena Browser. U všech těchto malignit byla zjištěna vysoká amplifikace MYC8,10. V obou souborech dat byly změny MYC CN určeny pomocí metody GISTIC score, kde hodnoty -2,-1,0,1,2, představovaly homozygotní deleci, heterozygotní deleci, diploidní, nízkoúrovňovou amplifikaci nebo vysokoúrovňovou amplifikaci32. Dále jsme provedli analýzu přežití pomocí skóre GISTIC předpovídajícího nízkoúrovňovou deleci/volný typ MYC oproti zisku/amplifikaci s použitím souboru dat PANCAN. Amplifikace MYC korelovala se zkráceným celkovým přežitím (p < 9,784 × 10-11, n = 2628) ve srovnání s případy s MYC CN WT/nízkoúrovňovou delecí (n = 1352) (obr. 1b). Poté jsme analyzovali korelaci mezi skóre GISTIC v lokusu MYC vs. expresí mRNA MYC a přežitím pacientů. Byla zjištěna silná korelace (spearmanovo r = 0,3339, p < 0,0001, n = 9697) mezi skóre MYC GISTIC a expresí mRNA MYC (obr. 1c). Vysoké (n = 1762) vs. nízké n = 1776) hladiny mRNA MYC byly spojeny se sníženým (p < 5,609 × 10-8) celkovým přežitím (obr. 1d). MYC je tedy zásadním onkogenem u mnoha lidských malignit a identifikace mechanismů antagonizace MYC u nádorových onemocnění by mohla mít terapeutické využití. Funkce MYC je zachována napříč evolučními hierarchiemi27,28,29,30,31. Jednoduchý životní cyklus prvoků vyžaduje, aby MYC při každém buněčném dělení vytvářel dceřiné buňky, které se podobají svým rodičovským buňkám27,29 . Evoluce od jednobuněčného organismu k mnohobuněčným organismům vedla k intenzivnímu využívání energie k otevření chromatinu a obnažení holé DNA, což umožnilo liniovým TF navázat a aktivovat stovky terminálních diferenciačních genů, které řídí osud buněk a jejich specializaci do různých vrstev. Tento proces nevyžaduje aktivně proliferující buňky. Proto je proliferace zprostředkovaná MYC v této fázi silně antagonizována33,34 (obr. 1e). Tato forma silného antagonismu MYC je rovněž nezbytná pro existenci mnohobuněčnosti29,35. Přesvědčivé je, že infekce mnohobuněčných organismů parazity prvoků zvyšuje transformaci infikovaných buněk v proliferační buňky pomocí komplexních mechanismů, které aktivují protein MYC a potlačují diferenciační TF27,29,36.

Na rozdíl od normálních buněk procházejí maligní buňky proliferací bez terminální diferenciace (obr. 1e, f). Tento aberantní proces je silně závislý na stabilizaci MYC a jeho koproteinů, které modulují buněčný růst a dělení17,20,37,38,39 . Genetické a epigenetické změny zajišťují, že u nádorových buněk dochází k trvalé proliferaci progenitorů vázaných na linii bez konečné diferenciace (obr. 1e)7. Za prvé, trvalé proliferace je dosaženo důslednou upregulací a chromozomovými zisky genetického lokusu kódujícího gen MYC u všech lidských malignit (obr. 1a). Amplifikace MYC předpovídá špatné celkové přežití (p-hodnota LogRank = 9,784 × 10-11, n = 3980) (obr. 1a, b). Ve studiích využívajících geneticky upravené myší modely (GEMM) nebo xenograftové modely rakoviny udržuje antagonizace MYC regresi nádoru u více nádorů39,40,41 . Například Shachaf a spol. vyvinuli transgenní myší model podmíněně exprimující MYC v hepatocytech pomocí exprese řízené tetracyklinem39. Inaktivace Myc vyvolala regresi myšího HCC zvyšující diferenciaci hepatocytů a hepatobiliárních buněk, ztrátu markeru HCC α-fetoproteinu a potlačení proliferace39. Na xenograftu PDAC se Zhang a spol. zaměřili na dimerizaci MYC-MAX pomocí malé molekuly (10058-F4), která narušuje transkripční aktivitu MYC40. Přidání 10058-F4 ke gemcitabinu vedlo k drastickému útlumu tumorigeneze ve srovnání s léčbou jednou látkou40. Soucek a kol. se na myším modelu rakoviny plic řízeném Krasem zaměřili na MYC pomocí dominantně negativního mutantu dimerizační domény MYC, který narušuje vazbu MYC na kanonický Myc E-box response element „CACGTG“, čímž inhibuje transaktivační aktivitu MYC41. Inhibice transaktivace MYC zvýšila přežití myší tím, že ukončila růst rakoviny plic41.

Z translačního hlediska existují různé problémy při pokusu o přímé farmakologické zacílení MYC42. Nejdůležitějším problémem je, že proliferace je vlastností normálních progenitorů a taková léčba by mohla mít špatný terapeutický index20. Kromě toho mají nádory heterogenní genetické pozadí, které přispívá k trvalé aktivitě MYC. Proto je pro pochopení mechanismů, které antagonizují nadměrné působení MYC, nezbytné definovat evolučně konzervované fyziologické metody, kterými normální progenitory antagonizují MYC, aby vypnuly intenzivní proliferaci, a jak je lze obnovit u nádorových onemocnění.

Ukončení proliferace zapojením apoptózy je pro normální dělící se buňky toxické

Pro zachování soudržnosti a integrity mezi různými typy buněk se v mnohobuněčných organismech vyvinul systém kontrol a rovnováhy souhrnně známý jako apoptóza43,44 . Hlavní TF apoptózy p53 (TP53) a jeho kofaktor p16 nebo p14ARF (CDKN2A) hrají klíčovou roli tím, že zastavují proliferující buňky, aby umožnily opravu poškození, nebo zahajují spořádanou sebevraždu, pokud takové poškození nelze opravit45,46 . Během embryogeneze je exprese p53 snížena, možná proto, že embryonální kmenové buňky se samy obnovují, aniž by exponenciálně proliferovaly47,48,49. Funkční studie diferenciální exprese p53 pomocí reportérových testů prokázaly vyšší expresi v pozdějších vývojových stadiích a sníženou expresi v terminálně diferencovaných buňkách48. Během buněčného dělení dráhy p53 účinně antagonizují dráhy MYC, aby zastavily proliferaci a umožnily poškozeným buňkám podstoupit opravu; neopravitelné buňky podléhají sebedestrukci prostřednictvím nevratné apoptózy, aby byla chráněna integrita celého organismu43. Vzhledem k tomu, že myši s vyřazeným p53 (KO) mají normální vývoj a nejsou zvětšené50, dokládá to, že apoptózní dráhy nejsou dominantním mechanismem používaným lineárními genitory k ukončení exponenciální proliferace. U myší s dvojitou KO Trp53 a fosfatázového a tenzinového homologu (Pten) se tedy vyvíjejí gliomové nádory, protože nedochází k antagonizaci MYC, ale tento fenotyp je pozorován pouze u dvojitých knokautů Trp53 a Pten45,46 . U PDAC je nejčastější mutací genu KRAS (~92 %). U GEMM, u nichž je mutovaný KRAS (KC myši) exprimován v buňkách pankreatu, se PDAC vyvine ve 30 až 40 % případů ve věku ~8-12 měsíců51. Přidání mutantního Trp53 k výše uvedeným GEMM (myši KPC) zvyšuje penetranci PDAC a snižuje přežití na ~5 měsíců, zatímco myši KC s delecí Ink4a přežívají ~2-3 měsíce52,53. U myší se samotným mutovaným Trp53 bez mutovaného Krasu se PDAC nevyvíjí53. Na myších modelech karcinomu vaječníků bylo naopak prokázáno, že inaktivace Trp53 vede k invazivním nádorům, ale vývoj nádoru je urychlen u myší se současnou inaktivací Brca1 a Trp5354.

TP53 a CDKN2A jsou často bi-alelně inaktivovány napříč lidskými malignitami (obr. 2a). Taková inaktivace má zásadní dopad na léčbu7. K ukončení maligní proliferace se konvenční chemoterapeutika zaměřují na upregulaci p53/p16 vyvoláním cytotoxického stresu, který napodobuje fyziologické aktivátory této dráhy55. Vzhledem k tomu, že maligní a normální buňky koexistují ve stejném prostředí, má taková léčba nepříznivý terapeutický index, protože tyto geny jsou v maligních buňkách mutované/fyzicky nedostupné, ale v normálních buňkách intaktní. Bylo zkoumáno mnoho metod, jak znovu zapojit apoptózu při léčbě rakoviny, ale bylo obtížné řešit tuto zásadní otázku terapeutického indexu56. Pokroky v genomických technikách ukazují, že pokud jsou geny TP53/CDKN2A divokého typu, jako je tomu u testikulárního karcinomu, léčba cytotoxickou chemoterapií (např. cisplatinou) vede k úplným odpovědím, které zvyšují celkové přežití a přežití bez onemocnění57 (obr. 2a, b). Zhoubné nádory s vysokou mírou inaktivace TP53/CDKN2A tyto odpovědi nevykazují, což vede k rezistenci vůči mnohonásobné léčbě založené na apoptóze (široká chemorezistence a radiorezistence) (obr. 2a, b, e, f)7 . Dokonce i různé typy nádorů pocházejících ze stejného orgánu mají lepší odpovědi na léčbu, pokud jsou geny pro apoptózu intaktní. Například mutace TP53 a CDKN2A se vyskytují u ~70, resp. 90 % PDAC58 (obr. 2a). Celková míra pětiletého přežití u PDAC je ~9 %, a to i při zahrnutí pacientů léčených chemoterapií nebo kombinovanou léčbou a/nebo chirurgickým zákrokem59,60. Naproti tomu pankreatické neuroendokrinní nádory (PNET) obecně nemají mutace TP53, vykazují pouze minimální delece CDKN2A61 a při léčbě terapií indukující apoptózu mají 5leté přežití >50 %62. Podobně multiformní glioblastom (GBM) vykazuje různé klinické, histopatologické a molekulární charakteristiky a skrývá mutace TP53 v ~30 % primárních případů a ~65 % sekundárních GBM63,64 . Gliomové buňky s WT TP53 reagují na cytotoxický stres vyvolaný klinicky dostupnými chemoterapeutiky ve srovnání s buňkami s transkripčně umlčeným mutovaným TP5365,66,67. Kromě toho v myším modelu PDAC indukovaném Trp53 (KPC) genetická inaktivace jedné alely Myc senzibilizuje terapeutickou odpověď gemcitabinu40. Proto jsme analyzovali genomické údaje porovnáním deseti nejčastějších malignit se zvýšenou frekvencí změn TP53/CDKN2A (TP53/CDKN2A-high) s deseti nejčastějšími malignitami s nízkou frekvencí změn TP53/CDKN2A (TP53/CDKN2A-low) (obr. 2b, c). Zjistili jsme, že u 7/10 nádorů s vysokou frekvencí TP53/CDKN2A došlo ke zkrácení doby přežití bez onemocnění a celkové doby přežití, pokud byly tyto geny mutovány (obr. 2b; tabulka S1) (p-hodnoty < 0,05). Konzistentně i u případů s nízkým obsahem TP53/CDKN2A došlo ke snížení doby přežití bez onemocnění a celkového přežití, když byly tyto geny změněny (p-hodnoty < 0,05) (obr. 2c; tab. S1). Míra změn v genech pro apoptózu je tedy nižší u vyléčitelných malignit (testikulární karcinom/pediatrická ALL) ve srovnání s vysoce refrakterními/rezistentními nádory (PDAC/HCC) (obr. 2g). Během fyziologického zrání vyvolává WT TP53 nevratnou apoptózu nezdravých buněk, aby byla zachována integrita celého organismu (obr. 2h). Naproti tomu onkogenní evoluce mutuje mediátory apoptózy, což vede k rezistenci vůči indukci apoptózy (obr. 2h).

Genetické a epigenetické změny diferenciačních genů u rakoviny

Nejagresivnější lidské malignity jsou špatně diferencované13. Přestože diferenciace přispívá ke špatnému přežití u mnoha lidských malignit, mechanismy, které jsou základem bránění diferenciaci u maligních buněk, jsou většinou nejasné, ale objevují se nové poznatky5,6,7. Pomocí publikovaných studií konverze linií nebo studií s transgenními myšími modely6,68,69,70,71,72,73,74 (tabulka 1) jsme identifikovali klíčové lineage master TF pro vývoj vaječníků, slinivky břišní a jater. Tato hrstka hlavních TF a jejich kofaktorů určuje programy buněčné diferenciace a liniového zapojení. I když významnou roli hraje více kofaktorů, nejdůležitější z nich jsou transkripční koaktivátory a korepresory, které využívají ATP k remodelaci chromatinu pro zapínání nebo vypínání cílových genů33,34,75 . V souladu s tím jsme analyzovali genetické změny v liniových TF, jejich koaktivátorech a korepresorech u OVC, PDAC a HCC (tab. 1).

Protože maligní buňky nemohou zcela potlačit diferenciaci, protože se jedná o kontinuum, podél něhož existují všechny buňky, hlavní TF, které určují zařazení do různých linií, nejsou mutací téměř nikdy zcela inaktivovány, ale často jsou haploinsuficientní (obr. 3a; tab. 1). Toto snížení dávky stačí k zastavení postupu podél diferenciačního kontinua v jeho nejproliferačnějších bodech5,6,7. Například ztráta FOXL1 byla častá u OVC (obr. 3a) a frekvence ztráty FOXL1 byla nejvyšší u špatně diferencovaných OVC (obr. 3b). Tento vzorec byl podobný pro GATA4 u PDAC a HCC, i když u těchto malignit byl malý počet pacientů, kteří přežívali po stadiu I a II (obr. 3b, c). Na základě analýzy literatury a údajů uložených v databázi UniProt (http://www.uniprot.org/) jsme identifikovali klíčové interakční partnery, kteří jsou koaktivátory a korepresory různých liniově specifických TF (tab. 1). K posílení zastavené diferenciace byly nalezeny koaktivátory často inaktivované a odstraněné (tab. 1; obr. 4a), které upřednostňují represi downstream genů cílených klíčovými TF. Nové důkazy nyní naznačují, že takové změny narušují dráhy zprostředkující terminální diferenciaci6,7,76. První objevy funkcí těchto koaktivátorových enzymů ukázaly, že jejich úloha ve fyziologii spočívá ve využití ATP k mobilizaci histonových interakcí DNA tak, že se obnaží holá DNA, což umožní TF navázat se na cílové geny a aktivovat je33,34,75,77 . Tento proces je v evoluci zachován od kvasinek78 , jednoho z nejjednodušších metazoí, až po homo-sapiens77. Inaktivace těchto genů u rakoviny by mohla být pokusem o narušení schopnosti koaktivátorů vystavit DNA hlavním TF, které aktivují následné geny. Hlavním vodítkem pro tuto hypotézu je, že hlavní TF linie jsou selektivní ve využívání specifických koaktivátorů ke zprostředkování aktivace genů linie (tab. 1). Dalším vodítkem je skutečnost, že maligní buňky mají tendenci ztrácet jednu alelu TF specifikujících linii, což může být dostatečné k tomu, aby se mohly zavázat k linii, ale nedostatečné pro terminální diferenciaci6,7 (obr. 3a; tab. 1). Například jaterní progenitory vyžadují spolupráci mezi GATA4 a FOXA1 pro rekrutování koaktivátorů (např. ARID1A) a zprostředkování aktivace genů pro diferenciaci hepatocytů. U HCC je častá heterozygotní ztráta GATA4 (68 %, n = 366, obr. 3a; tab. 1) a časté jsou inaktivační mutace v ARID1A (44 %, n = 366, obr. 4a; tab. 1)6. V játrech s jaterní haploinsuficiencí Gata4 nebo Arid1a je narušena jaterní diferenciace a zvýšena proliferace6,76,79. Navíc reintrodukce GATA4 u HCC s deficitem GATA4 nebo ARID1A u HCC s mutací ARID1A, ale intaktním GATA4, aktivuje stovky genů pro epiteliální diferenciaci hepatocytů6. Mezi hlavní TF pankreatické linie patří GATA4 a GATA680,81. U PDAC se vyskytují ztráty počtu kopií jedné alely těchto faktorů, přičemž byly pozorovány i mutace se ztrátou funkce u koaktivátorů (tab. 1; obr. 3a, 4a). PDAC však také vykazovaly vysoký výskyt amplifikace nebo zisku GATA4 a GATA6, což naznačuje, že v některých případech mohou tyto TF poskytovat růstovou výhodu buňkám karcinomu pankreatu. U OVC je často ztracena jedna alela ovariálního hlavního TF FOXL182,83 (80 %, obr. 3a; tab. 1 n = 316), zatímco koaktivátory, jako jsou ARID3A a ARID3B, jsou často inaktivovány (tab. 1; obr. 4a). V jádru maligní transformace tedy bránění diferenciaci běžně zvyšuje maligní proliferaci a dosahuje se ho prostřednictvím haploinsuficience hlavních TF a inaktivace koaktivátorů, které používají. Toto poznání by mohlo vést k léčbě zaměřené na opětovné zapojení dopředné diferenciace jako alternativy k apoptóze, jakožto prostředku k ukončení maligní proliferace.

Korepresorové enzymy: nové cíle pro onkoterapii obnovující diferenciaci

Korepresor se skládá z multiproteinových komplexů spolupracujících na aktivaci genů dané linie84,85, např, jaterní enhanceosomy aktivují geny hepatocytů6 , zatímco pankreatické a ovariální enhanceosomy aktivují pankreatické86 , resp. ovariální87 geny. Genetické narušení této spolupráce může posunout obsah těchto proteinových uzlů od koaktivátorů ke korepresorům, které místo toho potlačují lineární geny76,88,89. Taková represe je dále umožněna přirozeným stavem uzavřeného chromatinu u genů terminální diferenciace, který kontrastuje s přirozeně otevřeným chromatinem u genů proliferace a časné diferenciace6,7,90.

Pro exponenciální proliferaci probíhající odděleně od dopředné diferenciace je pro epigenetické umlčení genů lineární diferenciace nutný vysoký stupeň aktivity korepresorů. Aberantní aktivita korepresorů je proto často pozorována u maligních buněk, kde se u stovek genů terminální diferenciace hromadí aktivní korepresory6,89 . Na rozdíl od koaktivátorů, které jsou často inaktivovány genetickými mutacemi/delecemi6 , jsou korepresory v maligních buňkách často buď divokého typu, nebo amplifikované (tab. 1; obr. 4b). Enzym DNA metyltransferáza 1 (DNMT1) je korepresor pro hlavní TF a také udržovací metyltransferáza, která rekapituluje metylaci CpG na nově syntetizované vlákno DNA, když buňky procházejí cykly dělení91,92,93. V údajích TCGA PANCAN jsou vysoké hladiny DNMT1 spojeny se špatným přežitím (p < 0,00001, n = 5145) ve srovnání s případy s nízkými hladinami DNMT1 (n = 5199) (obr. 5a). To naznačuje důležitou roli tohoto enzymu u řady lidských nádorů. Proto se v posledním desetiletí rozvinula řada studií, které se pokoušejí vyvinout terapeutické zásahy zaměřené na DNMT1 při léčbě rakoviny94,95,96,97,98,99,100,101,102. Podobně s DNMT1 při regulaci metylace DNA úzce spolupracuje i UHRF1 (Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1)103,104 . Analyzovali jsme hladiny exprese UHRF1 v souboru dat PANCAN a zjistili jsme, že vysoké hladiny exprese UHRF1 (p < 0,0001, n = 5150) silně předpovídají špatnou míru přežití ve srovnání s nízkými hladinami (n = 5189) (obr. 5b), což ilustruje význam těchto metylačních genů u lidských nádorů.

Deplece DNMT1 bez cytotoxicity má terapeutický přínos i u myelodysplastického syndromu (MDS) a akutní myeloidní leukémie (AML) obsahující defekty systému p53102,105 a probíhá řada klinických studií, které hodnotí depleci DNMT1 v širším měřítku v terapii rakoviny (ačkoli decitabin a 5-azacytidin používané k depleci DNMT1 mají farmakologická omezení, která mohou oslabit jejich schopnost deplece DNMT1 ze solidních nádorů) (tabulka 2). U akutní promyelocytární leukemie (APL) se kompletní remise dosahuje kombinací arsenu s kyselinou retinovou, která inhibuje korepresory rekrutované na leukemickém fúzním proteinu PML-RARA106,107 . Vzhledem k tomu, že ko-represory nejsou u nádorových onemocnění mutované a mají aberantní aktivitu, jsou dostatečným a logickým molekulárním cílem, který může zapojit geny terminální diferenciace pro výstup z buněčného cyklu p537,89,99,100,102,105,108,109,110,111 (tab. 2; obr. 5c, d).

Různé další korepresory byly rovněž zkoumány jako potenciální molekulární cíle pro epigenetickou terapii rakoviny. Například enzymy histon deacetylázy (HDAC) jsou klíčovými korepresory rekrutovanými do TF uzlů mnoha lidských malignit a jsou známými epigenetickými supresory genové exprese5,6,88,89 . V mnoha preklinických studiích byly enzymy HDAC zkoumány jako potenciální induktory buněčné diferenciace94,95. Jedním z problémů při cílení na HDAC je však jejich pleiotropní buněčná funkce – i cílená aktivita tak může vyvolat nezamýšlené vedlejší účinky. Dalšími běžnými korepresory regulovanými u mnoha lidských malignit jsou enzymy lysin demetylázy, jako je KDM1A (obr. 4b). Různé studie prokázaly indukci diferenciace farmakologickým cílením na KDM1A a v současné době probíhají související klinické studie112,113,114,115,116. Carugo et al. nedávno pomocí vysoce výkonného celonádorového screeningu in vivo prokázali souvislost mezi korepresorem WDR5 a trvalou proliferací PDAC zprostředkovanou MYC117. Narušení WDR5 pomocí inhibičních testů vedlo k zastavení progrese nádoru a prodloužení přežití v PDX myších modelech PDAC117. V tomto systematickém přehledu jsme zdokumentovali další korepresory rekrutované do hlavních TF uzlů mnoha lidských malignit, které vyžadují další genetické a farmakologické ověření jako kandidátské molekulární cíle, které zvyšují diferenciaci. Patří mezi ně HES1, BAZ1A/B, BAZ2A, EED, SUZ12 a UHRF1 (obr. 4b, 5b; tab. 1). Dále bylo zjištěno, že upregulace těchto korepresorů souvisí s pokročilými klinickými patologickými stadii, což naznačuje přímý vliv na potlačení diferenciace. Například HES1 byl nalezen jako nejčastěji regulovaný korepresor u OVC (obr. 4b) a u OVC ve stadiu III a IV byl zjištěn vyšší zisk HES1 ve srovnání se stadii I a II (obr. 4c). Terapie inhibicí HES1 tak může mít zásadní význam pro diferenciační terapii OVC. Tento vzorec byl pozorován také u BAZ1B u PDAC a KDM1B u HCC (obr. 4b, d, e). Tato pozorování naznačují, že u těchto malignit by cílení na tyto klíčové enzymy pro indukci diferenciace mohlo poskytnout další terapeutické strategie, které obcházejí defekty systému p53.

.