2.19.2.3.3 Podmínky eluce

Efektivní eluční roztoky by měly v ideálním případě narušit interakce mezi analytem a protilátkou, aniž by nepříznivě ovlivnily imobilizované Abs. Vytěsňovač je vysoce koncentrovaná zkříženě reagující molekula schopná vyvolat biospecifickou desorpci. Molekuly displaceru soutěží s molekulami vázaného analytu a velký přebytek displaceru zajišťuje kvantitativní desorpci analytu. Pro optimální výkon musí displacer splňovat několik kritérií: (1) vysokou zkříženou reaktivitu s imobilizovanými protilátkami, (2) retenční čas výrazně odlišný od retenčního času analytů, protože velký přebytek způsobuje výrazný pík, který může snadno rušit detekci analytů, (3) dobrou stabilitu a vysokou čistotu, protože nečistoty přítomné v množství pouhých 0,01-0,1 % mohou narušit chromatogram, a (4) nízkou cenu, netoxické vlastnosti, nepřítomnost v reálných vzorcích a nízkou detekovatelnost ve srovnání s analyty. Kromě toho je nutný velký objem elučního roztoku, což vyžaduje rekoncentraci na klasickém SPE nosiči před analýzou. Proto se upřednostňují podmínky eluce umožňující úplnou výtěžnost cílového analytu při malém elučním objemu.

K eluci velkých molekul, jako jsou proteiny, se běžně používají haotropní ionty. Tyto ionty narušují strukturu vody kolem velkých molekul, tj. protilátek a cílových molekul, což vyvolává přerušení hydrofobních interakcí ve strukturách velkých molekul a mezi analytem a protilátkou. Nejběžnějšími chaotropními ionty jsou chloridové, jodidové, perchlorátové a thiokyanatanové ionty v koncentracích mezi 1,5 a 8 mol l-1. Ukázalo se však, že různé vodné roztoky, které lze úspěšně použít pro desorpci proteinů z IS, nejsou schopny desorbovat malé molekuly. Desorpce bílkovin je pravděpodobně založena především na změnách struktury vázané bílkoviny (částečná denaturace), a nikoli na změnách struktury imobilizovaných protilátek. Proto eluce malých molekul, které nejsou citlivé na denaturaci, vyžaduje mnohem přísnější podmínky. Kromě toho se při zvýšení teploty ze 4 °C na 43 °C může disociační konstanta interakcí mezi protilátkou a analytem zvýšit o dva řády. Tato metoda není dostatečně účinná, aby mohla být použita pro eluci malých molekul. K desorpci malých molekul z IS se často provádí eluce roztoky s nízkým pH, ale k tomu jsou zapotřebí tři jednotky pH od izoelektrického bodu protilátky. Tento způsob eluce (posun pH bez změny iontové síly) zabraňuje poškození labilních protilátek. Jednou z nepříjemností je, že k úplné desorpci jsou stále zapotřebí velké objemy, čímž se snižují faktory obohacení spojené s extrakčními postupy.

Účinné eluce malých molekul z IS lze dosáhnout pomocí sníženého objemu směsi vody a organického modifikátoru. Jako příklad je na obrázku 6 uveden eluční profil dvou herbicidů, isoproturonu a atrazinu, po průniku vzorku vody s příměsí každého analytu na odpovídající IS. Bylo hodnoceno několik elučních rozpouštědel (methanol, ethanol a ACN) ve směsi s vodou.

Obrázek 6. Eluční profily atrazinu, isoproturonu, 2,4,6-trichlorfenolu a pentachlorfenolu z odpovídajících IS při použití elučních roztoků obsahujících rostoucí množství organického rozpouštědla v okyselené nebo neokyselené vodě po průniku vzorků vody s příměsí každého analytu. ACN – acetonitril; MeOH – methanol; EtOH – ethanol; AA – kyselina octová; TFA – kyselina trifluoroctová.

Výsledné eluční profily silně závisí na charakteru rozpouštědla. Tři testovaná rozpouštědla umožňují úplnou eluci obou analytů. Nejvyšší eluční sílu však představuje ACN: nejnižší obsah tohoto rozpouštědla zajišťuje úplnou eluci obou analytů. Obsah ACN 40 % a 60 % postačuje k získání isoproturonu a atrazinu, zatímco methanol vyžaduje 60 % a 80 %. V tomto případě se zdá, že eluční síla rozpouštědla souvisí s jeho hydrofobní povahou, přičemž ACN (Hildebrandův parametr rozpustnosti δ = 24,3 MPa1/2) je méně polární než ethanol (δ = 26,0 MPa1/2) a methanol (δ = 29,7 MPa1/2). Tyto výsledky zřejmě naznačují, že interakce mezi herbicidy a jim odpovídajícími protilátkami jsou především hydrofobní povahy. Přítomnost nepolárních rozpouštědel snižuje hydrofobní složku interakce mezi protilátkou a analytem. Ovlivňuje však také stabilitu hydrofobních vazeb, zachování terciární struktury protilátky a vede k uvolnění antigenu. Tyto příklady týkající se eluce atrazinu nebo isoproturonu z odpovídajících IS ukazují, že účinné eluce se dosáhne přímým přidáním vysokého množství methanolu nebo ACN, 70-80 %, do eluční frakce. Toto vysoké množství organického modifikátoru umožní co nejvíce snížit objem eluční frakce, čímž se umožní koncentrace analytu v eluátu. Je třeba dbát na to, aby volba režimu vazby byla slučitelná s těmito elučními podmínkami. Použití nekovalentní vazby zabraňuje možnosti použít tak vysoké množství modifikátoru bez rizika narušení vazby protilátek ze sorbentu. Použití sol-gelového procesu pro imobilizaci protilátek rovněž omezuje možnost použití velkého množství organického rozpouštědla. Bylo prokázáno, že velké množství organického modifikátoru, jako jsou protilátky, způsobuje vymytí protilátek ze sol-gelové matrice.8

Někdy je nutná kombinace organického rozpouštědla a organické kyseliny. Na obrázku 6 je rovněž uveden eluční profil 2,4,6-trichofenolu a pentachlorfenolu z IS proti pentachlorfenolu při použití hydroorganické směsi s přídavkem a bez přídavku kyseliny do elučního roztoku. Trichlorfenol bylo možné zcela získat zpět buď pomocí vody/ACN (20:80, v/v), nebo vody/ACN (30:70, v/v) okyselené při pH 3 pomocí kyseliny trifluoroctové (TFA). Pokud bylo okyselení dosaženo 1% (v/v) kyselinou octovou (AA), byla pro eluci účinná směs obsahující pouze 30% ACN. Naproti tomu eluce pentachlorfenolu, který má vyšší afinitu k PAbs než trichlorfenol, nebyla možná s čistým ACN nebo ACN okyseleným TFA. Desorpce bylo možné dosáhnout pouze s vodou/ACN 20:80 (v/v) obsahující 1 % AA (v/v).

Ve většině off-line postupů, včetně postupů doporučených při použití jednorázových komerčních IS, se proto desorpce dosahuje s vysokým podílem organického rozpouštědla, někdy při nízkém pH.

Závěrem lze říci, že volba elučních podmínek závisí nejprve na afinitě mezi protilátkami a analyty. Závisí také na povaze analytu kvůli poměru mezi elektronickými a hydrofobními interakcemi, které se podílejí na interakcích mezi antigenem a protilátkou. A konečně závisí na strategii imobilizace protilátek; nekovalentní vazba zabraňuje použití velkého množství organických rozpouštědel

.