Invazivní test

Materiály:

Falcon 24 jamková deska pro tkáňové kultury

Vložka pro buněčné kultury Falcon:

Kat. č. 3097

Matrigel (ředěný vDMEM/F12)

5% glutaraldehyd v 1XPBS

0.5% Toluidinová modř v 2% Na2CO3

Příprava Boydenovy komory:

1. Pomocí sterilních kleští vyjměte vložky buněčné stěny z obalu a vložte je do jamek 24jamkové destičky.
2. Vložky 2x propláchněte 300 μl DMEM/F12

(Dávejte pozor, abyste se nepíchli do membrány)

1. Do středu každé jamky vložky s buňkami přidejte 20 μl Matrigela zředěného v poměru 1:6 (2-3 mg/ml proteinu). Jemně rozetřete Matrigel po celém povrchu membrány.
2. Umístěte potažené vložky do inkubátoru, aby Matrigel ztuhl na 20-30 min.

Příprava buněk pro test:

1. Ošetřete a vypěstujte buňky podle experimentálních podmínek. Může být žádoucí synchronizovat buňky do stejného růstového stavu.
2. Trypsinizace a počítání buněk
3. Odstraňte trypsin a resuspendujte s čerstvým médiem.
4. Rozložte 1X105 buněk do 200 μl definovaného média do horní komory.
5. Přidejte 300 μl média do spodní komory.
6. Kultivujte přibližně 20 hodin.

Doba se liší u různých buněčných linií a u méně invazivních buněk může být až 48 hodin.

Fixacea barvení:

1. Po kultivaci odsajte médium ze spodní komory
2. Přidejte 0,5 ml 5% glutaraldehydu v 1XPBS, inkubujte 10 min. @ R.T
3. Aspirujte roztok glutaraldehydu, každou jamku 3x promyjte D.W
4. Přidejte 0,5 ml 0,5% roztoku pro barvení toluidinovou modří do spodní komory, inkubujte 10-20 min @ R.T
5. Odstraníme roztok z horní i dolní komůrky, dolní komůrku 3x promyjeme D.W
6. Vnitřní povrch horní komůrky opatrně otřeme vatovým tamponem. (Dávejte pozor, abyste netlačili příliš silně, membrána by mohla vyskočit.) Invadované buňky budou uprostřed spodní části membrány.
7. Počítejte počet buněk pomocí q 20X objektivu mikroskopu. Počítejte nejméně 3 políčka na membránu.