Patogeneze tohoto onemocnění není zcela objasněna, kromě toho, že usazený keratin pochází z keratinocytů . Byly navrženy dva patogenetické mechanismy včetně apoptotické (fibrilární) teorie a sekreční teorie . Na základě apoptotické teorie následuje degenerace poškozených keratinocytů v bazální vrstvě a přeměna těchto koloidních tělísek dermálními histiocyty a fibroblasty na amyloid v papilární dermis (obrázek 2). Podle sekreční teorie se ložiska amyloidu pocházející z degenerovaných bazálních keratinocytů šíří do papilární dermis přes poškozenou lamina densa . V patogenezi makulární amyloidózy se uplatňuje několik etiologických faktorů: rasové faktory , genetická predispozice, faktory životního prostředí , pohlaví (ženy) , ženské hormony , expozice slunečnímu záření , tření (dlouhodobá abraze) , atopie , autoimunita (na základě asociace se systémovým lupus erythematodes, dermatomyozitidou, systémovou sklerózou, sarkoidózou a IgA nefropatií) a infekce EBV . EBV, jehož přítomnost byla zaznamenána v epidermis makulární amyloidózy, pravděpodobně působí jako faktor přispívající k degeneraci keratinocytů .

Obrázek 2

Malé kulovité hyalinní materiály amyloidu v papilární dermis.

Úloha EBV v etiopatogenezi primární kožní amyloidózy byla hodnocena pouze ve dvou předchozích studiích včetně jedné kazuistiky a série případů 27 pacientů z Číny . Vzhledem k nedostatku studií o souvislosti mezi EBV a makulární amyloidózou jsme se rozhodli provést v tomto ohledu studii v Íránu. Možná, že v případě asociace s EBV budou moci být v budoucnu k léčbě tohoto onemocnění použity antivirové látky.

2. Materiály a metody

V této studii případů a kontrol bylo do klinického vyšetření zařazeno 38 vzorků makulární amyloidózy a 38 vzorků zdravé kůže kolem excidovaných melanocytárních névů od pacientů bez makulární amyloidózy odpovídajícího věku a pohlaví na základě náhodného objektivně orientovaného výběru. Zařazovací kritéria zahrnovala parafinové bločky s dostatečným množstvím tkáně v archivech oddělení patologie nemocnice Imam Reza Hospital v Mašhadu s diagnózou makulární amyloidózy na základě patologické zprávy a klinického obrazu. Vylučovací kritéria zahrnovala bloky s nedokonalými údaji v záznamech a nedostatečné vzorky pro PCR.

Ve skupině případů bylo ukládání amyloidu potvrzeno optickou mikroskopií a barvením konžskou červení. V dalším kroku bylo z každého bloku ve skupině případů a kontrolní skupině připraveno šest 5 μm řezů za sterilních podmínek pomocí sterilního nože a byly umístěny do sterilních Eppendorfových zkumavek.

2.1. Analýza amyloidních depozit. Deparafinizace

K deparafinizaci parafinizovaných tkání byl použit xylol/etanol. Jeden ml xylolu byl přidán do mikrozkumavek obsahujících řezy tkání a inkubován při pokojové teplotě po dobu půl hodiny za stálého třepání. V dalším kroku byly mikrozkumavky odstředěny při 13 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut a jejich supernatant byl zlikvidován. Tyto dva kroky se jednou opakovaly. Ke sraženině bylo přidáno pět set μl 100% ethanolu, který byl po několika převráceních mikrozkumavky centrifugován po dobu 10 m při 13 000 otáčkách za minutu, a supernatant byl poté odstraněn. Tento krok byl znovu opakován. Nakonec byla výsledná sraženina umístěna při pokojové teplotě, aby se zcela odpařil ethanol, ale ne sraženina.

2.2. Extrakce DNA

Extrakce DNA byla provedena pomocí soupravy BIO BASIC INC (Kanada) s číslem šarže 8401-140116. K extrakci byl použit lyzační pufr T. V dalším kroku bylo do každé mikrozkumavky přidáno 100 μl extrakčního pufru a 10 μl proteinázy K, které byly promíchány. Ke směsi byly přidány vzorky tkání a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Poté byly vzorky inkubovány při 95 °C po dobu 3 minut, aby se inaktivovala proteináza K. Do zkumavek bylo přidáno sto μl univerzálního pufru NST a 10krát převráceno. Získaná směs byla použita pro PCR.

2.3. PCR

V této studii byla PCR použita ke zjištění přítomnosti genomu EBV u makulární amyloidózy. Po extrakci DNA z parafinizovaných bloků byla stanovena kvalita DNA extrahované z parafinizovaných tkání pomocí primerů beta-globinového genu. Primery beta-globinového genu GH20 a PC04 použité v této studii amplifikovaly fragment o velikosti 260 bp. Sekvence těchto primerů byla následující: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′. Vzorky produkující fragment o velikosti 260 bp při použití požadovaných primerů byly považovány za příznivé pro amplifikaci genu BLLF1 viru EBV.

Přítomnost sekvence EBV v extrahovaných vzorcích DNA byla testována pomocí soupravy Cinna Gen s číslem šarže 935701 (Sina Clon, Írán). Tato souprava byla navržena ke stanovení kvality EBV DNA v infikovaných vzorcích pomocí PCR. K míchání bylo použito optimalizované činidlo 1x PCR jako směs rekombinantní Taq DNA polymerázy, PCR pufru, MgCl2, dNTP a primerů. Pomocí primerů byla amplifikována vysoce specifická a repetitivní oblast genu BLLF1 kódujícího gp 350/220. Ty mohou detekovat nejméně 30 kopií EBV. Přítomnost fragmentů o délce 239 bp nebo 256 bp znamená pozitivní výsledek testu.

Analýza dat byla provedena pomocí softwaru SPSS 11.5.

. K popisu dat byly použity grafy a statistické tabulky a k porovnání EBV ve vzorcích zdravých a pacientů byly použity chí-kvadrát a nezávislé testy. Ve všech testech byla uvažována hladina významnosti 0,05.

3. Výsledky

Padesát procent pacientů tvořili muži (19/38) a 50 % ženy (19/38). Tři pacienti byli ve věkové skupině do 20 let (7,9 %), 5 pacientů 20-30 let (13,2 %), 10 pacientů 30-40 let (26,3 %), 13 pacientů 40-50 let (34,2 %), 4 pacienti 50-60 let (10,5 %) a 3 pacienti nad 60 let (7,9 %). Minimální a maximální věk byl 19 a 76 let. Bylo zaznamenáno 27 případů infekce v oblasti trupu (71,1 %) a 11 případů v oblasti končetin (28,9 %). Studijní a kontrolní skupina byly shodné z hlediska věku () a pohlaví ().

PCR byla provedena na gen beta-globinu u 76 vzorků (38 případů a 38 kontrol), který byl pozitivní u 61 vzorků (30 vzorků ve skupině případů a 31 v kontrolní skupině) a byl negativní u 15 vzorků (8 vzorků ve skupině případů a 7 v kontrolní skupině) (obrázek 3).

Obrázek 3

Výsledky PCR genu beta-globinu: z hlediska amplifikace jsou vzorky 1, 2 a 3 součástí pozitivního genu beta-globinu (260 bp pás) a vzorky 4, 5 a 6 jsou negativní. C+ a C- označují pozitivní, resp. negativní kontroly a M představuje DNA marker.

U 61 vzorků pozitivních na gen beta-globinu při PCR byl gen BLLF1 z EBV pozitivní ve 23 případech (8 případů ve studijní skupině a 15 případů v kontrolní skupině) a byl negativní ve 38 případech (22 případů ve studijní skupině a 16 případů v kontrolní skupině) (obrázek 4).

Obrázek 4

Výsledky PCR genu BLLF1 z EBV: vzorky 2, 4 a 5 jsou pozitivní (pásy 239 bp nebo 256 bp) a vzorky 1 a 3 jsou negativní. C+ a C- označují pozitivní, resp. negativní kontroly a M představuje DNA marker.

PCR genu BLLF1 z EBV byla 26,7 % pozitivní ve studované skupině a 48,4 % pozitivní v kontrolní skupině. Výsledky chí-kvadrát testu neprokázaly žádnou korelaci mezi EBV a makulární amyloidózou () (tabulka 1).

EBV DNA PCR Studijní skupiny Chi-square testu Případy Kontroly Počet Procenta Počet Procento Pozitivní 8 26.7 15 48,4 Negativní 22 91.7 16 76.2 Celkem 30 31 61

. Tabulka 1

Procentuální rozložení výsledků PCR z genu BLLF1 EBV u 30 pacientů s makulární amyloidózou a 31 vzorků melanocytárních névů mezi vzorky pozitivními na beta-globinový gen.

4. Diskuse

Amyloidóza je známa jako extracelulární depozita eozinofilního hyalinního materiálu vlastního původu se specifickými barvicími a ultrastrukturálními vlastnostmi. Toto onemocnění se může vyskytovat na pozadí systémových onemocnění nebo může být omezeno na kůži. Makulární amyloidóza je omezena na kůži . EBV může stimulovat sekreci amyloidního materiálu keratinocyty nebo může být podnětem k degeneraci keratinocytů a přeměně degenerovaných keratinocytárních vláken na amyloid . Nedávné studie naznačily úlohu epiteliálních buněk při pokračující reprodukci EBV. Buněčné povrchové receptory EBV nalezené v méně diferencovaném dlaždicovém epitelu naznačují přímou infekci epidermálních keratinocytů. K infekci může dojít v germinativních vrstvách; replikace viru je však možná pouze prostřednictvím zrání a diferenciace buněk. Exprese cytokeratinu v lidských keratinocytech se po infekci EBV mění in vitro, což vede k jejich přeměně na fibroblasty . Fibroblasty mohou fagocytovat keratinové agregáty a přeměňovat je na amyloid .

Drago et al. tuto korelaci prokázali v Itálii v roce 1996. Jejich pacientkou byla 30letá žena s desetiletou anamnézou svědivých hnědých papul a makul na hrudníku a zádech s příznaky chronického únavového syndromu. Pomocí techniky in situ hybridizace prokázali genom EBV v epidermálních lézích. EBV genom byl prokázán hlavně v bazálních epidermálních buňkách i v buňkách vyšších vrstev, zejména v cytoplazmě. Sérologické testy na EBV byly u pacienta rovněž pozitivní. Antivirová terapie aciklovirem a interferonem alfa zlepšila kožní léze a celkové příznaky u pacienta . Další studii provedl Chang et al. na kožní tkáni 27 pacientů s diagnózou lichen a makulární amyloidózy na Tchaj-wanu v roce 1997. Metoda in situ hybridizace prokázala EBV DNA v lézích 11 pacientů (40,7 %), zatímco v kontrolní skupině (zahrnující tři pacienty se sekundární kožní amyloidózou, dva pacienty s primární systémovou amyloidózou a čtyři pacienty s chronickým simplexním lichenem) EBV DNA chyběla .

Podle této studie nebyla zjištěna žádná souvislost mezi EBV a makulární amyloidózou (). V naší studii byla EBV DNA přítomna u 8 pacientů s makulární amyloidózou a 15 kontrol. Rozdíl v míře detekce EBV DNA mezi pacienty s makulární amyloidózou a kontrolami v této studii s uvedenými studiemi může být způsoben následujícími důvody: (1)Nedostatek asociace mezi makulární amyloidózou a infekcí EBV: existuje několik studií předkládajících nedostatečné důkazy pro definitivní korelaci mezi EBV a makulární amyloidózou, takže na základě výsledků naší studie jsme mohli učinit tento závěr (2)Metodika (PCR versus in situ hybridizace): použili jsme citlivou metodu detekce EBV DNA s pozitivní a negativní kontrolou. Na základě předchozích studií je PCR stejně citlivá jako hybridizace in situ . Protože jsme však nepoužili hybridizaci in situ, nemohli jsme v našich kontrolách přesně lokalizovat buňku infikovanou EBV, což mohly být cirkulující B buňky kůže místo keratinocytů. Vzhledem k tomu, že jsme v naší soupravě PCR pro EBV použili pozitivní a negativní kontroly, nemohly být pozitivní případy v naší kontrolní skupině falešně pozitivní. 3) Kontroly: Kontroly v naší studii tvořila zdravá kůže v okolí melanocytárních névů, ale kontroly v Changově studii tvořila jiná kožní onemocnění. 4) Typ kožní amyloidózy: V naší studii měli všichni pacienti makulární amyloidózu, ale v obou předchozích studiích měla většina pacientů lichenickou amyloidózu.

5) Typ kožní amyloidózy: V naší studii měli všichni pacienti makulární amyloidózu. Závěr

Podle výsledků této studie nebyla zjištěna žádná souvislost mezi EBV a makulární amyloidózou. Pro dosažení přesnějších výsledků srovnávací studie EBV DNA u makulární amyloidózy doporučujeme použít čerstvou tkáň nebo rychle zmrazený bioptický punktát a také současné sérologické vyšetření pacientů na přítomnost protilátek proti EBV. K lokalizaci EBV DNA pozitivních buněk ve vzorcích lze rovněž použít in situ PCR. K detekci EBV ve tkáni lze použít i jiné geny, protože některé vzorky EBV jsou mutované pro gen BLLF1 použitý v této studii .

Také doporučujeme provést srovnávací studii detekce EBV v postižené i nepostižené kůži pacientů s makulární amyloidózou.

Konflikt zájmů

Autoři nedeklarují žádný konflikt zájmů.

Poděkování

Autoři vyjadřují hluboké poděkování výzkumnému náměstkovi MUMS za finanční podporu a schválení výzkumného návrhu (č. 911283) týkajícího se diplomové práce Narges Nazeri. Děkujeme za finanční podporu ze strany výzkumného náměstka Mašhadské univerzity lékařských věd

.