Kvantifikace levého posunu leukocytů
Nejstaršími morfologicky rozpoznatelnými typy neutrofilů jsou myeloblast, promyelocyt a myelocyt. Tyto buňky dozrávají v metamyelocyty, poté v pásy a nakonec v segmentované neutrofily (obr. 7.4). Myeloblasty, promyelocyty a myelocyty jsou schopny buněčného dělení, což se prokázalo inkorporací tritiovaného thymidinu do jejich jaderné DNA a ověřilo přímým pozorováním v kultuře.22,23 Tato tři raná stadia neutrofilů se souhrnně označují jako mitotický kompartment neutrofilů nebo proliferační pool neutrofilů. Během infekce se v mitotickém kompartmentu neutrofilů obvykle přidá jedno nebo dvě další buněčná dělení, čímž se zvětší velikost proliferačního fondu.23 Přidáním jednoho dalšího dělení se zdvojnásobí počet vzniklých zralých neutrofilů. Během infekce se počet promyelocytů a myelocytů v kostní dřeni typicky zvyšuje kvůli přidaným buněčným dělením.24
Neutrofil left shift je výraz používaný k označení abnormálního nárůstu nezralých neutrofilů v cirkulaci.25-27 Jednou z metod kvantifikace levého posunu, zejména v novorozenecké hematologii, je poměr nezralých a celkových neutrofilů (I/T).25-30 Mechanismem dodávání většího množství neutrofilů do infikovaných tkání je předčasné uvolňování nezralých postmitotických neutrofilů (metamyelocytů a pásů) z kostní dřeně do oběhu. To vede ke zvýšení poměru.26,31-35
Poměr I/T neutrofilů vyžaduje manuální diferenciální počet buněk; hematologický technolog mikroskopicky vyšetří 100 leukocytů na obarveném krevním filmu a spočítá každou buňku podle morfologických charakteristik. Poměr I/T se obvykle vypočítá jako podíl procenta pásových neutrofilů plus metamyelocytů a procenta segmentovaných neutrofilů plus pásových neutrofilů plus metamyelocytů. Druhou běžnou metodou kvantifikace levého posunu je absolutní počet pásových neutrofilů, který rovněž vyžaduje manuální diferenciál. Procento leukocytů identifikovaných jako pásy se vynásobí počtem leukocytů a hodnota se vyjádří jako pásy/μl krve.36 Spolehlivost poměru I/T je ovlivněna velkými rozdíly mezi pozorovateli v klasifikaci neutrofilů jako pásů nebo segmentovaných forem.29
Automatický diferenciální počet leukocytů je relativně novou inovací v klinické laboratorní hematologii; velké množství leukocytů je kategorizováno průtokovými cytometrickými technikami podle jejich velikosti a cytoplazmatických a jaderných charakteristik.4,28,37 Malá část promyelocytů, myelocytů a metamyelocytů uniká z kostní dřeně a nachází se v krvi a lze je měřit některými hematologickými analyzátory. Při automatickém diferenciálním počtu buněk na některých modelech hematologických analyzátorů Sysmex je levý posun kvantifikován nezralými granulocyty (IG). Tyto výsledky mohou být uváděny jako procento nezralých granulocytů (IG%) nebo absolutní počet nezralých granulocytů (IG/μl). IG% a IG/μl jsou do jisté míry analogické, ale technicky odlišné od poměru I/T neutrofilů a absolutního počtu pásem. Výhodou automatizovaného diferenciálu je, že nevyžaduje krevní nátěr ani čas technika na provedení mikroskopické analýzy.4,5 Navíc byla u dospělé populace zaznamenána lepší výkonnost automatizovaného diferenciálu oproti manuálním metodám na základě mnohem většího vzorku sečtených leukocytů. Rovněž je odstraněna lidská chyba při rozlišování mezi jednotlivými typy buněk, protože přiřazení buněčného typu je určeno automaticky pomocí přednastavených technik gatingu.38 Obr. 7.5 ukazuje kanál diferenciálu bílých krvinek (WDF) vytvořený analyzátory Sysmex.6
V mnoha klinických laboratořích nahradily automatizované diferenciální počty u dospělých pacientů manuální počty.5,39 Překážkou pro zavedení automatizovaných diferenciálů leukocytů v neonatologii byl nedostatek referenčních intervalů pro IG% a IG/μl u neonatální populace.40 Také užitečnost IG% a IG/μL jako biomarkerů infekce nebyla přímo porovnána s poměrem I/T neutrofilů a absolutním počtem pásů u infikovaných a neinfikovaných novorozenců.
Referenční intervaly (5. a 95. percentil dolní a horní hranice) pro IG% a IG/μL byly vyvinuty s použitím krevního obrazu novorozenců bez známek infekce. Na obr. 7.6 jsou uvedeny grafy referenčních intervalů pro IG% a IG/μl pro první týden po narození.41
Čtyři metody kvantifikace levého posunu měly podobnou statistickou výkonnost pro naznačení diagnózy infekce (tab. 7.1). U každé ze čtyř metod byla senzitivita slabá (12-15 %), zatímco specificita silná (90-95 %) a pozitivní prediktivní hodnota (PPV) a negativní prediktivní hodnota (NPV) se obvykle pohybovaly v rozmezí od nízkých do středních 60 %. Jejich kombinace měly tendenci snižovat senzitivitu, ale zvyšovat PPV.41
Poměr I/T neutrofilů není citlivou metodou identifikace infekce, ale vysoká hodnota je pro infekci poměrně specifická. Poměr IG/μl a počet pásem si vedly podobně jako poměr I/T a IG%. Tato zjištění nás vedla k závěru, že pro většinu účelů by měl automatizovaný diferenciál sloužit stejně dobře jako manuální diferenciál, podobně jako závěry vyvozené z krevního obrazu získaného od dospělých.39,42 Navíc jsme zjistili tři manuální diferenciální počty, u kterých jsme předpokládali, že se jedná o chyby v transpozici (pásy umístěné do sloupce seg a naopak). Tyto případy měly mimořádně vysoké poměry I/T (>0,8), ale pacienti vypadali dobře a při okamžitém opakování krevního obrazu byly poměry I/T normální (<0,2). K takovým chybám by při automatickém diferenciálním počtu nedošlo.
CBC s diferenciálem leukocytů je jedním z nejčastějších laboratorních vyšetření, které se objednává u novorozenců a malých dětí. Došli jsme k závěru, že jako způsob kvantifikace levostranného posunu leukocytů jsou IG% a IG/μl z automatizovaného diferenciálního počtu na hematologickém analyzátoru Sysmex srovnatelné s poměrem I/T a absolutním počtem pásem na základě manuálního diferenciálního počtu, i když hodnoty IG a I/T špatně korelují. Automatizovaný diferenciální počet leukocytů pomocí jiných typů buněčných čítačů by měl být rovněž porovnáván s manuálním diferenciálním počtem. Došli jsme k závěru, že automatizovaný diferenciální počet by měl být pro neonatologii dostačující. U vybraných novorozenců, u nichž je účelem krevního obrazu identifikace infekce, by přidání manuálního diferenciálního počtu mohlo mírně zlepšit výsledky testu.
.