Abstrakt
Popisuje se odvození kvantitativního modelu metabolismu fenylalaninu u lidí. Model je založen na kinetických vlastnostech čisté rekombinantní lidské fenylalaninhydroxylázy a na odhadech rychlosti transaminace fenylalaninu a degradace bílkovin in vivo. Vypočtené hodnoty ustálené koncentrace fenylalaninu v krvi, rychlosti clearance fenylalaninu z krve po perorálním podání aminokyseliny a tolerance fenylalaninu v potravě se dobře shodují s údaji od normálních pacientů i od pacientů s fenylketonurií a obligátních heterozygotů. Tyto vypočtené hodnoty mohou pomoci při rozhodování o míře omezení příjmu fenylalaninu, která je nezbytná k dosažení uspokojivého klinického výsledku u klasických pacientů a u pacientů s mírnějšími formami onemocnění.
Počátečním a rychlost limitujícím krokem v úplném katabolismu fenylalaninu na CO2 a vodu je jeho hydroxylace na tyrosin, reakce katalyzovaná hydroxylačním systémem fenylalaninu. Tento systém je složitý a skládá se z fenylalaninhydroxylázy (PAH), pterinového koenzymu tetrahydrobiopterinu (BH4) a několika enzymů, které slouží k regeneraci BH4, tj, dihydropteridin reduktasu a pterin 4α-karbinolamin dehydratasu (1, 2).
Ačkoli benzenový kruh fenylalaninu nemůže být roztržen, aniž by byl nejprve hydroxylován v para poloze, alaninový postranní řetězec aminokyseliny může být metabolizován i bez kroku hydroxylace kruhu. Tato alternativní cesta je zahájena transaminací fenylalaninu na fenylpyruvát s následnou přeměnou této sloučeniny na metabolity, jako je fenyllaktát, fenylacetát a o-hydroxyfenylacetát. Produkty transaminázové dráhy se vylučují močí. Jednotlivé kroky těchto alternativních cest metabolismu fenylalaninu jsou uvedeny na obr. 1.
Na začátku je třeba poznamenat, že předchozí pokus o provedení takové analýzy byl ztížen nedostatkem údajů o kinetických vlastnostech lidské PAH a lidské fenylalanin-transaminázy. U posledně jmenovaného enzymu totiž nebyla s jistotou známa ani identita toho, který je za tuto aktivitu in vivo odpovědný. Protože důkazy in vitro naznačovaly, že fenylalanin je vynikajícím substrátem pro mitochondriální aspartátaminotransferázu, předpokládalo se, že se jedná o tuto transaminázu. Kromě toho, protože vlastnosti lidského protějšku nebyly známy, byly použity kinetické vlastnosti odpovídajícího krysího enzymu (12). Způsob, jakým byl problém lidské transaminázy řešen v této analýze, bude diskutován níže.
Kinetické vlastnosti rekombinantní lidské PAH jsou nyní k dispozici (16, 17). Kinetika PAH je poněkud komplikovaná tím, že fenylalanin slouží nejen jako substrát pro enzym, ale také jako aktivátor (viz ref. 1 a odkazy v něm). Protože předchozí analýza kinetického chování PAH založená na dvoumístném modelu s uspořádanou vazbou fenylalaninu jak v katalytickém, tak v regulačním místě mohla dostatečně vysvětlit mnohé zvláštní aspekty kinetického chování enzymu (18), byl v této analýze použit podobný dvoumístný model s uspořádanou vazbou. Aktuální použitá rychlostní rovnice (19) je znázorněna v rovnici 2, kde Km je koncentrace fenylalaninu, která dává polo-maximální rychlost, a Ka je koncentrace fenylalaninu, která dává polo-maximální aktivaci v experimentu, v němž byl PAH předinkubován s různými koncentracemi fenylalaninu. Pro tuto analýzu byly použity následující kinetické konstanty stanovené s čistým rekombinantním lidským PAH při 37 °C s BH4 jako koenzymem: Km pro fenylalanin 0,51 mM a Ka pro fenylalanin jako aktivátor 0,54 mM (D. Kowlessur a S.K., nepublikované údaje). Přibližná hodnota Vmax pro lidskou PAH (16) (pravděpodobně podhodnocená) byla vypočtena z počáteční rychlosti poklesu sérových hladin fenylalaninu (0,9 μmol/ml za hodinu) u kontrolních osob poté, co dostaly perorální dávku l-fenylalaninu, která stačila ke zvýšení sérových hladin fenylalaninu ≈17krát (20). 
2 Jak bylo uvedeno výše, předchozí problém identity enzymu u člověka, který je zodpovědný za transaminaci fenylalaninu, byl při této analýze obejit. Předpokládalo se, že hlavní cestou čisté likvidace fenylalaninu u pacientů s klasickou PKU je transaminace. Například, jak již bylo uvedeno, vylučování fenylalaninu močí představuje pouze ≈11 % množství, které je transaminováno, a na konci prvního roku života lze odhadnout, že množství fenylalaninu zlikvidovaného inkorporací do bílkovin představuje pouze ≈25 % množství zlikvidovaného transaminací. Je třeba poznamenat, že při současné metodě odhadu rychlosti transaminázy fenylalaninu, která je založena na rychlosti clearance fenylalaninu z krve, jsou do odhadu aktivity transaminázy zahrnuty méně významné reakce pro likvidaci fenylalaninu, jako je jeho vylučování močí a jeho zabudování do bílkovin, což vede k malému nadhodnocení této aktivity.
K tomu, aby byla tato analýza užitečná, jsou zapotřebí hodnoty Km a Vmax transaminázy. Byly učiněny pokusy získat hodnotu Km pro transaminaci fenylalaninu z výsledků testů zatížení fenylalaninem provedených na pacientech s klasickou PKU (21). Přístup použitý při odhadu hodnoty Vmax pro lidský transaminující enzym spočíval v použití údajů o součtu všech metabolitů odvozených od transaminace (tj. fenylpyruvátu, fenyllaktátu a o-hydroxyfenylacetátu) vyloučených skupinou pacientů s klasickou PKU v závislosti na jejich plazmatických hladinách fenylalaninu. Maximální vyloučené množství, vyjádřené jako mmol/mol kreatininu, bylo 1 370, což je hladina, která se zdála být na vrcholu při plazmatických hladinách fenylalaninu mezi 1 200 a 2 400 μmol/litr (22).
Pokusy převést tuto hodnotu na rychlost transaminace jsou komplikovány širokým věkovým rozmezím, od ≈2 let do ≈18 let, ve vzorku pacientů použitém ve studii. Pro tuto analýzu se předpokládalo, že průměrná tělesná hmotnost pacientů je 50 kg a že denní vylučování kreatininu je 2 g/24 h (23). Dále byl přijat předpoklad, že vylučování metabolitů odvozených od transamináz probíhá během 24 h lineárně a odráží rychlost tvorby těchto metabolitů. Rovněž se předpokládalo, že tyto sloučeniny se vyrovnávají se všemi tělesnými tekutinami s výjimkou husté chrupavčité pojivové tkáně a kostí, které dohromady představují 15 % celkové tělesné vody (24), což dává distribuční objem přístupné vody 500 ml/kg tělesné hmotnosti. Na základě těchto předpokladů byla maximální rychlost transaminace vypočtena na 0,043 μmol/ml za hodinu.
Dalším produktem metabolismu fenylalaninu, který je alespoň částečně odvozen od fenylpyruvátu a který nebyl ve studii Langenbecka a spol. (22) měřen, je fenylacetylglutamin (PAG). Existují důkazy, že PAG může vznikat z fenylacetátu, který je odvozen z fenylpyruvátu oxidativní dekarboxylací (25). Bylo také navrženo, že fenylacetát, a tedy i PAG, může vznikat z fenylalaninu cestou, která nezahrnuje transaminaci, ale zahrnuje dekarboxylaci na fenyletylamin s následnou oxidací aminu na fenylacetát (26). Zjištění, že množství fenyletylaminu vyloučeného u pacientů s PKU je malé i poté, co byla oxidace aminu zablokována podáním inhibitoru aminoxidázy (27), však naznačuje, jak již bylo uvedeno dříve (12), že dekarboxylace fenylalaninu je kvantitativně minoritní cestou pro metabolismus fenylalaninu, stejně jako pro tvorbu PAG.
Množství PAG vylučované normálními jedinci je 250-500 mg/den; pacienti s PKU vylučují dvojnásobné množství (28). Pro účely výpočtu množství PAG tvořeného transaminázovou cestou byl přijat konzervativní předpoklad, že z fenylpyruvátu pochází pouze „extra“ množství vyloučené pacienty. Vezmeme-li v úvahu průměrné extra množství vyloučeného PAG 350 mg/den a přijmeme-li stejné předpoklady, které byly uvedeny výše, znamená toto vyloučení rychlost tvorby PAG 0,020 μmol/ml za hodinu, čímž se rychlost tvorby všech transaminovaných produktů zvýší na 0,063 μmol/ml za hodinu.
Při použití této hodnoty Vmax byly pro výpočet použity výsledky zátěžového testu s fenylalaninem provedeného na pacientech s klasickou PKU (21).37 ± 0,14 mM (průměr ± SD, n = 3) pro Km fenylalanin-transaminázy.
Protože v této analýze jsou aktivity PAH a transaminázy počítány jako funkce hladin fenylalaninu v krvi, je důležité, aby tyto hladiny odrážely tkáňové hladiny této aminokyseliny. V této souvislosti bylo zjištěno, že hladiny fenylalaninu v jaterní tkáni pacienta s PKU (29) a v jaterní a ledvinové tkáni hyperfenylalanémických potkanů (30) jsou srovnatelné s odpovídajícími hladinami v krvi.
Třetí člen v rovnici 2, rychlost čistého odbourávání bílkovin, byl odhadnut na základě údajů Waterlowa a Jacksona (31), které ukazují, že ve stavu nalačno, tedy ve stavu, za kterého se provádí zátěžový test s fenylalaninem, je čisté odbourávání bílkovin (tj, množství odbouraných bílkovin minus množství syntetizovaných) se rovná 0,30 g/kg tělesné hmotnosti za 12 hodin. Protože kosterní sval tvoří ≈40 % tělesné hmotnosti (24) a katabolismus bílkovin v této tkáni hraje hlavní roli při dodávání aminokyselin na periferii, bylo odbourávání bílkovin v kosterním svalu bráno jako převažující událost v odbourávání bílkovin, ke kterému dochází během hladovění.
Lidský kosterní sval obsahuje ≈46 μmol fenylalaninu/g tkáně (32). Na základě této hodnoty a zjištění, že sval dospělého člověka obsahuje 19,8 % bílkovin (33), lze odhadnout, že sval obsahuje 232 μmol fenylalaninu/g svalové bílkoviny. Pokud bychom tuto hodnotu považovali za reprezentativní pro zásoby tělesných bílkovin, znamenalo by to, že se během 12 h nalačno uvolní ≈70 μmol fenylalaninu/kg tělesné hmotnosti. Na základě stejných předpokladů, jaké byly učiněny výše při odhadu rychlosti transaminace fenylalaninu, by se poslední hodnota promítla do hodinové rychlosti čisté degradace bílkovin (a uvolňování fenylalaninu z tohoto procesu) 0,012 μmol/ml za h. Protože substrát pro tuto reakci, totiž tělesné zásoby bílkovin, by pravděpodobně zůstal během krátké doby hladovění relativně konstantní, předpokládalo se, že degradace bílkovin probíhá podle kinetiky nulového řádu.
Složením odhadovaných hodnot kinetických konstant pro tři reakce uvedené ve vzorci 1 získáme vzorec 3: 
3
VÝSLEDKY A DISKUSE
Obecnou platnost vzorce 3 lze posoudit několika způsoby. Za prvé, s použitím výrazu pro rychlost reakce katalyzované PAH, včetně kinetických konstant uvedených v rovnici, byla vypočtena základní rychlost hydroxylační reakce 0,010 μmol/ml za hodinu. Tato hodnota se dobře shoduje s následujícími hodnotami uváděnými pro normální subjekty na základě experimentů, při nichž byl subjektům podáván l-fenylalanin: 0,013 μmol/ml za h; 0,008 μmol/ml za h (34); 0,012 μmol/ml za h (5); 0,010 μmol/ml za h (6). Hodnota 0,020 μmol/ml za h byla zjištěna v poslední studii, kdy byl subjektům infundován l-fenylalanin (6). Všechny citované rychlosti přeměny fenylalaninu na tyrosin in vivo byly uváděny jako μmol/h na kg. Byly převedeny na μmol/ml za hodinu na základě stejných předpokladů, které byly použity dříve, tj. že distribuční objem metabolitů, jako je fenylalanin, je 500 ml/kg tělesné hmotnosti. Tyto výsledky ukazují, že vypočtená rychlost hydroxylace fenylalaninu se dobře shoduje s experimentálně zjištěnou rychlostí.
Dalším testem platnosti modelu je výpočet hladiny fenylalaninu v krvi v ustáleném stavu jak pro kontrolní subjekty, tak pro heterozygoty PKU, u nichž se předpokládá 50% normální aktivita PAH, a také t1/2 pro clearance zátěže fenylalaninu (tj, doba potřebná k poklesu počáteční koncentrace fenylalaninu na polovinu původní hodnoty) z krve pro tyto dvě skupiny. Hladina fenylalaninu v ustáleném stavu u kontrol, vypočtená z rovnice 3 (nastavením členu „-dPhe/dt“ na nulu a výpočtem koncentrace fenylalaninu), je 0,059 mM a u subjektů s 50% zbytkovou aktivitou PAH je 0,079 mM, což je 1,34krát více než u kontrol. Ačkoli hodnota 0,059 mM pro normální subjekty dobře souhlasí s přijatou hodnotou 0,058 ± 0,015 mM (průměr a SD) (35), hodnota 0,079 mM pro heterozygoty, u nichž lze očekávat 50 % normální hladiny PAH, se zdá být příliš nízká. Uvádí se, že poměr hladin fenylalaninu v krvi u kontrol a obligátních heterozygotů PKU je spíše v rozmezí 1,57-1,61 (36-38) než poměr 1,34, který byl předpovězen modelem.
Tato vypočtená hodnota zvyšuje možnost, že heterozygoti PKU mohou mít méně než 50 % kontrolní aktivity PAH. Dosazením hodnoty 40 % kontrolní aktivity PAH pro heterozygoty do rovnice 3 získáme koncentraci fenylalaninu v ustáleném stavu 0,093 mM; při použití této hodnoty a hodnoty 0,058 mM pro kontroly získáme poměr 1,60, který se blíží rozsahu uváděnému pro heterozygoty a kontroly (viz výše). V této souvislosti je třeba poznamenat, že reziduální aktivita PAH ve vzorcích jaterní biopsie zjištěná u šesti HPA obligátních heterozygotů se pohybovala mezi 5,8 a 31 % kontrolních hodnot (39). Tyto výsledky poskytly první indikaci, že HPA heterozygoti mají výrazně nižší aktivitu než 50 % kontrolní hodnoty. Dvě následné větší studie rodičů pacientů s PKU byly v souladu s těmito dřívějšími výsledky: jedna studie uváděla průměrnou hodnotu 29,3 % kontrol (n = 9) (40) a další uváděla průměrnou hodnotu 28,1 % (n = 8) (41).
Model také předpovídá hodnoty t1/2 pro clearance fenylalaninu z krve pro normální jedince i heterozygoty, které jsou v souladu se skutečnými klinickými výsledky. Pro normální jedince je získána hodnota 65 min, což je méně než uváděná průměrná hodnota 89 min, ale v rozmezí 60-120 min (10). U heterozygotů s 50 % a 40 % reziduální aktivitou PAH jsou hodnoty t1/2 vypočtené podle rovnice 3 144, resp. 180 min ve srovnání s uváděnou průměrnou hodnotou 159 min .
Dříve byla zmíněna zpráva o dvou pacientech s HPA, jejichž neschopnost metabolizovat fenylalanin se zdála být důsledkem nedostatku transaminázy (11), a důkazy proti tomuto závěru (12). Tento model poskytuje další důvod, proč se na toto tvrzení dívat skepticky. Obr. 2 ukazuje časový průběh vymizení 1 mM fenylalaninu z plazmy kontrolního subjektu (křivka A) i subjektu s nedostatkem transaminázy, ale s normální hladinou PAH (křivka B). Jak je vidět, obě rychlosti jsou téměř stejné, takže je velmi nepravděpodobné, že by výrazná HPA mohla být způsobena nedostatkem transaminázy. Důvodem téměř totožné rychlosti obou rychlostí je to, že rychlost mizení fenylalaninu při úplné absenci PAH (křivka D) je velmi malá, počáteční rychlost je pouze 2,6 % rychlosti kontroly s normální hladinou PAH. Na obr. 2 (křivka C) je také zobrazena rychlost likvidace fenylalaninu u jedince se 40 % normální hladiny PAH, což je deficit aktivity PAH, který, jak bylo uvedeno výše, může představovat průměr u heterozygotů PKU.
Vypočtené rychlosti likvidace zátěže fenylalaninem u kontrol a u jedinců s různými genotypy. A, kontroly; B, jedinec s nulovou aktivitou transamináz; C, jedinec se 40 % kontrolní aktivity PAH; D, jedinec s 0 % kontrolní aktivity PAH.
Posledně byli pacienti s PKU klasifikováni zařazením do fenotypových kategorií na základě tolerance fenylalaninu v potravě. Pacienti s klasickou PKU tolerují méně než 20 mg/kg fenylalaninu denně, aby si udrželi hladinu fenylalaninu v krvi na přijatelné úrovni 0,3 mM, pacienti s „mírnou PKU“ tolerují 20-25 mg/kg denně a pacienti s „mírnou PKU“ tolerují 25-50 mg/kg denně (42).
Aby se zjistilo, zda jsou tyto hodnoty tolerance fenylalaninu ve stravě v souladu s předpovědí podle rovnice 3, předpokládalo se, že příjem povoleného množství fenylalaninu je rovnoměrně rozdělen do tří „jídel“. Pro pacienty s klasickou PKU s příjmem fenylalaninu 15 mg/kg denně by každé jídlo obsahovalo 5 mg/kg denně a přidalo by 0,06 μmol/ml k výchozí hodnotě 0,30 μmol/ml pro celkovou hladinu fenylalaninu v plazmě 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Dosazením této hodnoty do rovnice 3 (za předpokladu, že Vmax u pacienta s klasickou PKU je rovna nule) se -dPhe/dt rovná 0,001 μmol/ml za hodinu, tj. při této hladině fenylalaninu rychlost mizení fenylalaninu prostřednictvím transaminační reakce jen o málo převyšuje rychlost vstupu fenylalaninu do plazmatického poolu prostřednictvím čisté degradace bílkovin. Proto rovnice 3 předpovídá, že tito pacienti s PKU by mohli tolerovat příjem fenylalaninu 15 mg/kg denně.
Počítáno stejným způsobem, pacienti se „středně těžkou PKU“ s tolerancí fenylalaninu ve stravě 25 mg/kg denně by potřebovali k jeho metabolizaci v rovnici 3 zbytkovou aktivitu PAH rovnající se 15 % aktivity divokého typu.Podobně pacienti s „mírnou PKU“ s tolerancí fenylalaninu ve stravě 50 mg/kg denně by potřebovali zbytkovou aktivitu PAH ve výši 25 % aktivity divokého typu, aby přidaný fenylalanin metabolizovali přibližně za 3 hodiny.5 h. Tyto výsledky naznačují, že rovnice 3 může vysvětlit toleranci dietního fenylalaninu pozorovanou u těchto různých skupin pacientů.
Bylo by užitečné pokusit se korelovat tyto odhady reziduální aktivity PAH pro pacienty s „mírnou PKU“ a „středně těžkou PKU“ s reziduální hydroxylázovou aktivitou měřenou in vitro pro mutantní druhy PAH, které pacienti chovají. V současné době je však takový pokus ztížen, protože v údajích in vitro je příliš velký rozptyl. Bylo tedy prokázáno, že několik pacientů klasifikovaných jako pacienti se „středně těžkou PKU“ (42) je nositelem následujících tří mutantních forem PAH (v závorce jsou uvedeny jejich in vitro reziduální aktivity PAH vyjádřené jako procento aktivit divokého typu): L348V (25 %), R261Q (30 %, 47 %) a R158Q (10 %) (43). Je vidět, že tyto hodnoty se liší téměř pětinásobně. Jak již bylo uvedeno dříve (2, 43), obecně platí, že in vitro odhady zbytkové hydoxylázové aktivity mutantů PAH bývají vyšší než odhady pozorované v jaterních biopsiích. Přinejmenším jedním z důvodů této tendence je, že in vitro aktivity PAH se obvykle měří pomocí nasycených koncentrací fenylalaninu a BH4, jak bylo provedeno u mutanty R261Q (44). Vzhledem k této situaci je možné, že reziduální aktivity PAH odhadnuté pomocí rovnice 3 se mohou ukázat jako lepší odraz aktivit in vivo než aktivity měřené in vitro.
Tento model metabolismu fenylalaninu je relevantní pro závěr, ke kterému došel Thompson a jeho kolegové (45, 46) na základě výsledků získaných infuzí deuteriem značeného fenylalaninu a tyrosinu subjektům, že pacienti s klasickou PKU mají „značnou“ aktivitu PAH, která se rovná přibližně 76 % aktivity kontrolních subjektů. Tato překvapivě vysoká aktivita hydroxylace fenylalaninu byla připsána tyrosinhydroxyláze (45). Jak již bylo uvedeno, výsledky shrnuté na obr. 2 ukazují, že při absenci PAH je dávka fenylalaninu z krve odstraňována méně než 3 % rychlostí pozorovanou u kontrol. Z této analýzy nevyplývá, že by u lidí existovala nějaká alternativní cesta, která by dokázala zlikvidovat velké množství fenylalaninu. Nedávno van Spronsen et al. (34) poukázali na možný metodologický problém metody použité Thompsonem a spolupracovníky.
Shrnem lze říci, že kvantitativní výsledky získané pomocí modelu metabolismu PAH jsou v souladu s údaji, které nepřímo odrážejí aktivitu PAH in vivo, jako jsou hladiny fenylalaninu v krvi v ustáleném stavu, rychlost clearance (konvenčně vyjádřená jako hodnoty t1/2) fenylalaninu z krve po zátěži fenylalaninem a tolerance fenylalaninu ve stravě. Model má potenciál kvantitativně odhadnout zbytkovou aktivitu PAH z kterékoli z těchto hodnot, zejména z naměřených rychlostí clearance po zátěži fenylalaninem. Předpovězené zbytkové hladiny PAH nebo z nich odvozené hodnoty mohou být užitečné při rozhodování o tom, jak přísné musí být dietní omezení fenylalaninu, aby bylo dosaženo požadované hladiny fenylalaninu v krvi. Tabulka 1 shrnuje hodnoty t1/2 a hladiny fenylalaninu v krvi v ustáleném stavu vypočtené podle rovnice 3 (za předpokladu, že během testovacího období není přijímán žádný fenylalanin) pro různé úrovně reziduální aktivity PAH, jakož i srovnatelné hodnoty z příslušných klinických údajů.
- Zobrazit inline
- Zobrazit vyskakovací okno
Hladiny fenylalaninu v krvi v ustáleném stavu a hodnoty t
pro clearance fenylalninu vypočtené podle rovnice 3. 3 pro různé hladiny PAH
Poznámky
-
↵* Komu adresovat žádosti o reprint. e-mail: kaufman{at}codon.nih.gov.
ABBREVIATIONS
PAH, fenylalaninhydroxyláza; PKU, fenylketonurie; HPA, hyperfenylalaninemie; PAG, fenylacetylglutamin