Azid sodný indukuje mitochondriemi zprostředkovanou apoptózu v buňkách PC12 prostřednictvím signální dráhy spojené s Pgc-1α

Úvod

Azid sodný (NaN3) je jako bílý, bezbarvý a krystalický prášek klasifikován jako vysoce toxická látka. Jeho toxické účinky jsou podobné účinkům kyanidu a poškozuje nervový a kardiovaskulární systém, oči a kůži. Tento toxický prvek začíná být aktivní rychle po požití a jeho hlavní účinky se projevují několik hodin po perorálním požití v závislosti na požitém množství (1,2). Expozice NaN3 může během několika minut vyvolat řadu příznaků, včetně nevolnosti, zvracení, bolesti hlavy, neklidu, závratí, slabosti, zrychleného dýchání a zrychleného srdečního tepu (3). Vysoká množství tohoto toxického prvku okamžitě vyvolávají křeče, ztrátu vědomí, nízkou srdeční frekvenci a krevní tlak a selhání dýchání, což nakonec vede k úmrtí (3). Mezi prokázanými mechanismy účinku NaN3 je nejvýznamnější inhibice komplexu cytochromoxidázy a dýchacího řetězce (4). Předchozí studie odhalily, žeNaN3, inhibitor komplexu IV (Cox IV), může indukovatapoptózu v primárních kortikálních neuronech, která je závislá na kaspáze-3 a je spojena s uvolňováním cytochromu c (5).

Při mitochondriální biosyntéze může být promotorrespiračního řetězce Cox IV aktivován jadernými respiračními faktory (Nrf)-1/2. V případě, že se jedná o inhibitor komplexu Cox IV, může dojít k jeho aktivaci. Současně může být Nrf upraven regulací aktivity genů kódujících mitochondriální transkripční faktor A (Tfam), aby nepřímo reguloval úroveň exprese genů respiračního řetězce. Nrf-1/2, Tfam, peroxizomový proliferátorem aktivovanýreceptor γ koaktivátor 1-α (Pgc-1α) a další koaktivátory tvoří signální kaskádu Pgc-1α, která hraje ústřední roli v regulační síti řídící transkripční kontrolumitochondriální biogeneze a respirační funkce. V této signální kaskádě Pgc-1α nejprve aktivuje Nrf-1/2 na rozdíl od přímé vazby na mitochondriální DNA a Nrf-1/2 indukuje aktivaci Tfam v kombinaci s promotorem Tfam a spouští transkripci a replikaci mitochondriální DNA, což vede ke zvýšení hladiny exprese mitochondriálních proteinů(6). Současně může být Pgc-1α aktivován signálními cestami zprostředkovanými CaN-, Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinázou (CaMK), mitogenem aktivovanou proteinkinázou (MAPK) a cyklin-dependentní kinázou (7). V této studii byly buňky PC12 použity k vytvoření modelu dopaminového neuronu a byly zkoumány účinky a mechanismy působení NaN3 na dráhy spojené s Pgc-1α v buňkách PC12, aby se zjistilo, zda NaN3 vyvolává toxicitu u kultivovaných buněk PC12 a jaké mechanismy se na těchto účincích podílejí.

Materiál a metody

Materiál

Buňky PC12 feochromocytomu potkanů byly zakoupeny z buněčné banky sbírky typových kultur Čínské akademie věd (Šanghaj, Čína). Zásobní roztok NaN3(Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Německo) byl rozpuštěn ve sterilním fyziologickém roztoku, aby vznikl 1 M zásobní roztok, který byl následně před experimentem naředěn na požadované koncentrace. Jednokroková souprava pro detekci apoptózy TUNEL (C1090), souprava pro detekci apoptózy Annexin V-fluorescein isothiokyanát (FITC) (C1063), souprava pro zesílenou detekci adenosin 5′-trifosfátu (ATP) (S0027), JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay kit (C2006) a Reactive Oxygen Species Assay kit (S0033) poskytl Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Čína).

Buněčná kultura a test životaschopnosti

BuňkyPC12 byly udržovány v Dulbeccově modifikovanémEagle’s médiu (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) a 1% roztokem antibiotika Antimycotic sestávajícího z 10 000 U penicilinu a 10 000 U streptomycinu. Buňky byly inkubovány při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2 a vždy byly použity při 70-80% konfluenci.

Životaschopnost buněk PC12 byla stanovena pomocí soupravy pro počítání buněk (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, Čína). Buňky byly nasazeny do 96jamkových destiček v hustotě 1×105/jamku. Po 24hodinové kultivaci byly buňky ošetřeny NaN3 (0-80 mM) a inkubovány po dobu 12, 24, 48 a 72 hodin pro vytvoření modelu buněčného poškození. Následně bylo do každé jamky přidáno 10 µl roztoku CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) a inkubováno další 2 h za standardních podmínek (37 °C a 5 % CO2). Absorbance při vlnové délce 450 nm byla stanovena pomocí ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA). Životaschopnost buněk byla vypočtena podle průměrné optické hustoty 6jamek. Experimenty byly prováděny ve třech opakováních. Vhodné koncentrace NaN3 pro použití v následnýchexperimentech byly stanoveny podle výsledků testů buněčné životaschopnosti.

Jaderná morfologie buněkPC12 barvených DAPI

BuňkyPC12 byly vystaveny působení 0, 10, 20 a 40 mMNaN3 po dobu 24 hodin. Za účelem rozlišení programované buněčné smrti od buněčné smrti bez apoptózy byla jádra obarvena pomocí 10 µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Krátce, buňky byly dvakrát promyty PBS a poté fixovány 4%paraformaldehydem při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po třech promytích byly fixované buňky barveny DAPI (1:5000) po dobu 5 minut a poté promyty PBS. Fluorescenční snímky byly pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu Leica DMI (zvětšení, ×400).

Měření rychlosti apoptózy

K stanovení apoptózy buněk byla použita souprava Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kit (Beyotime Institute of Biotechnology) podle pokynů výrobce. experimenty byly opakovány ve třech opakováních a byly provedeny následujícím způsobem: U kontrolních buněk PC12 (0 mMNaN3) a buněk PC12 vystavených působení 10, 20 a 40 mMNaN3 po dobu 24 hodin byla měřena míra apoptózy pomocí průtokové cytometrie (FC500;Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Statistické analýzy byly provedeny pomocí statistického softwaru SPSS v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA).

Měření mitochondriálního membránového potenciálu (ΔΨm)

ΔΨm je významným parametrem mitochondriální funkce. Byl hodnocen pomocí barvení fluorescenční sondou JC-1. Experimenty byly opakovány ve třech opakováních a byly prováděny takto: Kontrolní buňky PC12 byly ošetřeny 0 mM NaN3 a experimentální buňky PC12 byly vystaveny působení 10, 20 a 40 mM NaN3 po dobu 24 h. Následně byly podle protokolu výrobce (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Čína) buňky inkubovány s médiem obsahujícím JC-1 (1X) při 37 °C po dobu 20 min, buňky byly třikrát promyty promývacím pufrem a odebrány s čerstvým médiem bez séra. Současně byla pozitivní kontrola ošetřena inhibitorem karbonylkyanid3-chlorfenylhydrazonem (CCCP) (10 µM) při 37 °C po dobu 20 min. Poté byla stanovena červená/zelená fluorescence pomocí FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Poměr intenzity červené fluorescence k intenzitě zelené fluorescence představoval hladinu ΔΨm.

Měření produkce reaktivních forem kyslíku (ROS)

ROS v buňkách PC12 byla hodnocena pomocí soupravy ReactiveOxygen Species Assay (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, Čína). Intracelulární tvorba ROS byla hodnocena pomocí 2′,7′-dichlorfluorescein diacetátu (DCFH-DA), fluorescenční sondy. Intracelulární ROS oxidují DCFH-DA za vzniku fluorescenční sloučeniny 2′,7′-dichlorfluoresceinu (DCF) a intenzita fluorescence DCF je považována za paralelní s množstvím vytvořených ROS podle pokynů soupravy pro stanovení ROS.Experimenty byly opakovány ve třech opakováních a prováděny takto: Pozitivní kontrola byla ošetřena specifickou koncentrací Rosupu (50 mg/ml); kontrolní buňky PC12 byly ošetřeny 0 mMNaN3; a experimentální buňky PC12 byly vystaveny 10, 20 a 40 mM NaN3 po dobu 24 h. Kromě toho byly buňky PC12 ošetřeny DCFH-DA (10 mM) rozpuštěným v bezsérovém DMEM (1:1 000) po dobu 20 min při 37 °C a poté třikrát promyty bezsérovým DMEM. Pozitivní kontrola byla ošetřena Rosupem, aby se indukovala produkce ROS. Produkce ROS byla stanovena pomocí FCM (FC500;Beckman Coulter, Inc.). Střední intenzita fluorescence (MFI) představovala úroveň ROS.

Měření obsahu buněčného ATP v buňkáchPC12

Experimenty byly opakovány ve třech opakováních a prováděny následujícím způsobem: Kontrolní buňky PC12 byly ošetřeny 0 mMNaN3 a experimentální buňky PC12 byly vystaveny působeníNaN3 v různých koncentracích (10, 20 a 40 mM) po dobu24 h. Následně byl stanoven obsah buněčného ATP pomocí soupravyFirefly Luciferase ATP Assay (Beyotime Institute ofBiotechnology) podle protokolu výrobce.

Western blot analýza

BuňkyPC12 byly vystaveny působení 0, 10, 20 a 40 mMNaN3 po dobu 24 h, lyzovány v radioimunoprecipitačním analytickém pufru (Beyotime Institute of Biotechnology) obsahujícím inhibitor aproteázy a odstředěny při 13 362 × g po dobu 10 min při 4 °C, aby byl odebrán supernatant. Následně byla stanovena koncentrace proteinů pomocí soupravy BCA (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Stejná množství proteinů (90 µg) byla podrobena 10 a 12% SDS-PAGE a poté přenesena na polyvinylidenfluoridové membrány (0,45 µm) pomocí Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Po zablokování 5% hovězím sérovým albuminem v TBS obsahujícím 0,5 % hovězího sérového albuminu a 0,5 % hovězího sérového albuminu.1% Tween-20 (TBST) po dobu 2 h při pokojové teplotě byly membrány inkubovány s primárními protilátkami proti Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1 000), Tfam (Abcam;1:1 000), prokaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc.), Danvers, MA, USA, 1:500), pankalcineurin A (CaN;Cell Signaling Technology Inc.; 1:1 000), fosforylovaný (p)-CaMKII(Cell Signaling Technology; 1:1 000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.; 1:1 000), p-extracelulárním signálem regulovaná kináza(Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1 000), B-celllymphoma-2 (Bcl-2)-asociovaný protein X (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) a cytochrom c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) při 4 °C přes noc. Membrány byly poté promyty TBST a inkubovány se sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou (HRP) (králík; kat. č. 1). A0208;1:1 000; nebo myší; kat. č. A0216; 1;1 000; obě Beyotime Instituteof Biotechnology) po dobu 1 h při pokojové teplotě. Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány pomocí systému zvýšené chemiluminiscence (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Čína) a kvantitativně analyzovány pomocí programu Image J verze l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA) a jako kontrola zatížení byl zvolen β-aktin.

Statistická analýza

Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí statistického softwaru SPSS v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Údajejsou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka směrodatná chyba průměru. Statistická významnost rozdílů mezi skupinami byla stanovena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu s následnýmBonferroniho post-hoc testem. P<0,05 bylo považováno za statisticky významný rozdíl. Každý experiment byl opakovánnejméně třikrát.

Výsledky

NaN3 inhibuje růst buněkPC12

Vliv expozice NaN3 naproliferaci buněk PC12 byl hodnocen pomocí CCK-8 testu. Buňky byly vystaveny různým koncentracím (0-80 mM) NaN3 po dobu 12-72 h. TabulkaI a obr. 1A-D ukazují, že životaschopnost buněk byla snížena NaN3 v závislosti na koncentraci. Téměř 100 % buněk odumřelo po expozici 80 mM NaN3 po dobu 72 h, což naznačuje, že NaN3 výrazně vyvolal buněčnou smrt a že cytotoxicita NaN3 byla zjištěna v závislosti na dávce a čase. Expozice NaN3 o koncentraci 20 mM po dobu 24 h způsobila u buněkPC12 výraznou buněčnou smrt (50 %). Proto byly pro další experimenty použity buňky kultivované po dobu 24 h.

Tabulka I.

NaN3 potlačuje růst buněk PC12 (n=6).

Morfologie buněk

Při barvení DAPI byly pozorovány morfologické změny buněk PC12 pomocí fluorescenčního mikroskopu po vystavení různým koncentracím NaN3. Byla pozorována fragmentace buněčných jader vystavených působení NaN3 po dobu 24 hodin a smršťování buněčných jader a kondenzace chromatinu se mírně zvyšovaly s koncentrací NaN3 v buňkách PC12 ve srovnání s kontrolou. V těchto buňkách byly apoptotické buňkymenší a světlejší ve srovnání s normálními buňkami. Byla také pozorována chromatickákondenzace a jaderná fragmentace, zatímco v kontrolní skupině byla identifikována modrá jádra životaschopných buněk. kromě toho se v buňkách vystavených působení NaN3 zvýšil počet apoptotických buněk a intenzita zelené fluorescence (obr. 2).

Stanovení míry apoptózy pomocí barvení anexinem V-FITC

Mrtvé buňky nebo pozdní apoptotické buňky, které ztratily integritu buněčné membrány, se mohou barvit propidium jodidem. V důsledku ztráty integrity buněčné membrány může annexin V-FITC proniknout do cytoplazmy a spojit se s fosfatidylserinem uvnitř buněčné membrány, čímž se u mrtvých buněk projeví zelená fluorescence.Obr. 3 ukazuje, že počet apoptotických buněk činil 5,03, 8,02, 43,77 a 78,67 % (P<0,05) u buněk PC12 po expozici NaN3 v různých koncentracích (0, 10, 20 a 40 mM) po dobu 24 hodin. Tyto výsledky navíc potvrdily, žeNaN3 indukoval apoptózu buněk v závislosti na dávce.

Změny mitochondriálního membránového potenciálu (ΔΨm)

Mitochondrie jsou obecně považovány za klíčové regulační organely podílející se na životaschopnosti buněk. Proto byl ΔΨm použit jako ukazatel mitochondriální funkce. Buňky PC12 byly obarveny kationickým barvivem JC-1, které vykazuje akumulaci v mitochondriích v závislosti na potenciálu. Červená fluorescence (J-agregáty), představující aktivní mitochondrie se stabilním membránovým potenciálem, byla pozorována u malého počtu buněk vystavených rostoucí koncentraci NaN3. Naopak zelená fluorescence (J-monomer), představující apoptotické mitochondrie s poškozeným ΔΨm, byla pozorována v řadě buněk. Poměr červené a zelenéfluorescence se v kontrolní skupině postupně snižoval (obr. 4).

NaN3-indukovaná akumulace mitochondriálních ROS

Je dobře známo, že mitochondrie jsou primárnímzdrojem buněčných ROS a ROS slouží k aktivaci apoptotické signalizace. Proto byla dodatečnězkoumána úloha ROS vNaN3-indukované smrti buněk PC12. Obr. 5 ukazuje, že intenzita fluorescence u kontrolních buněk a buněk vystavených působení NaN3 v různých koncentracích (0, 10, 20 a40 mM) po dobu 24 hodin byla 3,65, 6,99, 18,63 a 39 %.35, což naznačuje, že expozice NaN3 významně zvýšila produkci mitochondriálních ROS ve srovnání s kontrolní skupinou (P<0,05). Tyto výsledky naznačují, že NaN3 indukovanáapoptóza zlepšila produkci intracelulárních ROS.

NaN3 snižuje themitochondriální produkci energie buněčného ATP

Pro vyhodnocení obsahu ATP v buňkách PC12 vystavenýchNaN3 byla luminometrem kvantitativně stanovena relativní luminiscenční jednotka (RLU). Obr. 6 ukazuje, že NaN3inhiboval mitochondriální produkci ATP a postupně snižoval hladinu buněčného ATP (P<0,05).

Hladiny exprese Pgc-1α a proteinů spojených s apoptózou v buňkách PC12

Exprese Pgc-1α na úrovni proteinů byla po expozici NaN3 významně snížena ve srovnání s kontrolou (P<0,05). Kromě toho jsou Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2,Nrf-2 a Cox IV dobře známými downstream cíli dynamiky Pgc-1α v různých typech buněk (8). Tato studie zjistila, že expozice NaN3 významně inhibovala dynamiku Pgc-1α v závislosti na dávce (P<0,01; obr. 7A).

Kromě toho expozice NaN3 zvýšila hladiny exprese Bax a cytochromu c, zatímco snížila hladiny exprese Bcl-2 a prokaspázy-3(P<0,05). Poměr Bax/Bcl-2 byl také významně zvýšen ve srovnání s kontrolní skupinou (P<0,05; obr. 7B).

Byly také hodnoceny hladiny exprese proteinů dalších důležitýchčlenů, včetně CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK a p-p38 MAPK. Výsledky ukázaly, že NaN3zvýšil expresi CaN a fosforylaci CaMKIIa p38 MAPK ve srovnání s kontrolní skupinou, zatímco hladiny exprese celkové CaMKII a p38 MAPK se nezměnily. Kromě toho byly poměry p-CaMKII/CaMKII a p-p38/p38 MAPK ve skupiněNaN3 významně zvýšeny ve srovnání s poměry v kontrolní skupině (P<0,01; obr. 7C).

Diskuse

Pro zjištění, zda NaN3 inhibujeproliferaci buněk PC12, byl počet ošetřených buněk vlogaritmické fázi porovnán s počtem neošetřených kontrolních buněk. Po 24hodinové expozici 20 mM NaN3 byl růst buněk inhibován o ~75 %. Proto byla tato koncentrace použita pro další experimenty. Apoptóza zahrnuje změny buněčné morfologie, včetně krvácení membrán, smršťování buněk, kondenzace chromatinu, fragmentace jader a fragmentace DNA(9). Pro dodatečnou analýzu jaderné morfologie apoptózy a rychlosti apoptózy byly buňky vystaveny působení 0, 10, 20 a 40 mM NaN3 po dobu 24 h. Po ošetření byly buňky obarveny DAPI a AnnexinV-FITC/PI a byla analyzována distribuce jader. Výsledky potvrdily, že expozice NaN3 indukovala apoptózu u buněk PC12 v závislosti na koncentraci.

Mitochondrie se podílejí na mnoha metabolických funkcích, včetně udržování intracelulárního pH a produkce ROS, které podporují a regulují buněčnou apoptózu (10). Charakteristickým znakům buněčné apoptózy předcházejí mitochondriální změny, včetně ztráty ΔΨm, snížení produkce energie (ATP) a zvýšení permeability mitochondriální membrány. Předchozí studie naznačily, žeROS vyvolává poškození mitochondriálního dýchacího řetězce a způsobuje ztrátu ΔΨm, což jsou faktory, které zprostředkovávají nebo zesilují neuronální dysfunkci v průběhu neurodegenerace, což následně vede k rozvoji neurodegenerativních onemocnění (11,12).Je známo, že NaN3 způsobuje degeneraci a excitotoxicitu tím, že zvyšuje permeabilitní potenciál mitochondriální membrány prostřednictvím peroxidace lipidů (13-15) a NaN3 působí primárně toxicky tím, že inhibuje funkci cytochromoxidázy v mitochondriálním řetězci přenosu elektronů a zabraňuje produkci ATP (4). V této studii byla FCM použita k identifikaci ΔΨm a produkce ROS v buňkách PC12. Dále byla zkoumána ATPsyntéza v mitochondriích po vystavení různým koncentracím NaN3. Narušení plazmatické membrány, zvýšení produkce mitochondriálních ROS a pozorovaný pokles obsahu buněčného ATP naznačují, že expozice NaN3 vyvolala v buňkách PC12 apoptózu.

Mitochondriální buněčná smrt může být aktivována více podněty, včetně vývojového programu, poškození DNA,stresu endoplazmatického retikula, nedostatku růstových faktorů a živin, virové infekce a oxidačního stresu (16). Jako člen stále se rozrůstající rodiny jaderných koregulátorů může Pgc-1α aktivovat velký soubor genů a regulovat úroveň exprese genů zapojených do energetického metabolismu v reakci na signální dráhy, které zprostředkovávajítermogenezi, glukoneogenezi, změnu typu svalových vláken amitochondriální biogenezi (17).Tyto koregulátory existují a fungují ve velkých multiproteinovýchkomplexech, v nichž spíše než vazbu na DNA regulujíNrf-1/2 a Tfam a modulují jejich transkripční účinnost tím, že podporují následné biochemické interakce nutné pro indukci nebo represi genové transkripce (8). Kromě toho Nrf-1/2 také nepřímo kontroluje expresi genů kódovaných mitochondriální DNA tím, že potenciálně indukuje jaderně kódované Tfam A, B1 a B2 (Tfam,Tfb1m a Tfb2m), které jsou regulátory transkripce a replikace mitochondriálního genomu (18). Předchozí studie prokázaly, že NaN3 je inhibitorem komplexu IV mitochondriálního dýchacího řetězce, který je často postižen při primárních mitochondriálních poruchách (19,20). v této studii byla nejprve zkoumána exprese signální kaskády Pgc-1α včetně proteinů rodiny Pgc-1α (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 a Tfam) a Cox IV v buňkách PC12, aby se ověřilo, zda se signální děje podílejí na apoptóze vyvolané NaN3. Výsledky naznačují, že NaN3 indukovaná apoptóza souvisí s úrovní exprese proteinů rodiny Pgc-1α a Cox IV v signální dráze zprostředkované mitochondriemi. Když se koncentrace NaN3 zvýšila,hladiny exprese těchto proteinů se významněsnížily, což naznačuje, že se mohou podílet na aktivaci a rozvoji apoptózy.

Komplex IV může naopak vyvolat apoptózu v primárních kortikálních neuronech, která je závislá na kaspáze3 a je spojena s uvolňováním cytochromu c (5). Je dobře známo, že mitochondrie jsou klíčovými regulátory buněčné apoptózy. Proteiny rodiny Bcl-2 jsoudůležitými iniciátory mitochondriální apoptotické dráhy. Tatorodina zahrnuje proapoptotické proteiny Bax, Bcl-2 homologníantagonista/killer a Bcl-2 asociovaný agonista buněčné smrti a antiapoptotické proteiny Bcl-2 a Bcl-extra large (Bcl-xL). Ve zdravých buňkách je Bax neaktivní cytosolický protein, ale během apoptózy je přemístěn do mitochondrií. Vykonává svéproapoptotické účinky tím, že vytváří pór v mitochondriální vnější membráně, kterým se cytochrom c uvolňuje do cytoplazmy, což vede k aktivaci kaspázy 3 (21). Antiapoptotické proteiny Bcl-2a Bcl-xL potlačují funkci Bax tím, že udržují integritumitochondriální membrány, což brání uvolnění cytochromu ca aktivaci kaspázy 3 (22). V této studii NaN3 zvýšil hladiny proapoptotických Bax acytochromu c a snížil hladiny anti-apoptotických Bcl-2 aprokaspázy 3, což naznačuje, že NaN3 inicioval signalizacimitochondriální apoptózy v buňkách PC12.

Kromě toho jsou hladiny exprese koaktivátorů Pgc-1α vysoce indukovatelné na transkripční úrovni prostřednictvím různých předcházejících signálních drah. Napříkladexprese Pgc-1α je indukována cvičením a vystavením chladu podkontrolou stresové signalizace prostřednictvím buněčné signalizace Ca2+ a cyklického adenosin-5′-monofosfátu (cAMP) (23). Transkripci Pgc-1α mohou ovlivňovat CaMK, kalcineurin, β-adrenergní receptor/cAMP a p38MAPK (24-26). Kromě toho p38 MAPK patřící do rodiny MAPK plní klíčovou funkci v buněčné proliferaci, diferenciaci, transformaci a apoptóze, protože aktivace apoptózy může indukovat Pgc-1α prostřednictvím přímé fosforylace (27). V této studii byly zkoumány hladiny exprese proteinů v signálních drahách Ca2+ (pan-calcineurin A a p-CaMKII/CaMKII) a dráze p38 MAPK (p-p38MAPK/p38 MAPK a p-Erk1/2), aby se zjistil vliv NaN3 na intracelulární Ca2+homeostázu a p38 MAPK. Data ukázala, že hladiny proteinu pankalcineurinu A a poměry p-CaMKII/CaMKII a p-p38MAPK/p38 MAPK byly zvýšeny a hladina p-Erk1/2 byla snížena ve skupině léčené NaN3, což naznačuje, že NaN3 spustil apoptózu buněk PC12 v závislosti na dávce a tato aktivace byla spojena s cestami Ca2+ a p38 MAPK. Celkově tyto experimentální výsledky potvrdily, že NaN3 může vyvolat apoptózu buněk PC12 aktivací Ca2+ a p38 MAPKdráhy. Podle našich nejlepších znalostí tato studie poprvé odhalila, že NaN3 indukuje u buněk PC12 apoptózu zprostředkovanoumitochondriemi prostřednictvím signálních drah spojených sPgc-1α, včetněCa2+/p-CaMKII a p38 MAPK.

Shrnem tato studie prokázala, žeNaN3 může indukovat apoptózu buněk PC12. Za účelem objasnění základního toxického mechanismu expozice NaN3 byly zkoumány hladiny exprese řady proapoptotických proteinů (Bax a cytochrom c) a anti-apoptotických proteinů (Bcl-2, prokaspáza-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII a Pgc-1α). Výsledky potvrdily, že proapoptotické proteiny působí na buňky PC12 proapoptoticky prostřednictvím aktivace a fosforylace CaMKII a p38 MAPK, což stimuluje aktivaci Pgc-1α a prokaspázy-3 v buňkách PC12. Tyto údaje poskytují základ pro následnéstudie zkoumající mechanismy působení NaN3 na molekulární úrovni. Budoucí studie mohou zahrnovat přidání ochranných látek, například inhibitoru mitochondriálního dělení 1, derivátu chinazolinonu, který je nově identifikovaným inhibitorem mitochondriálního dělení, před léčbou NaN3, aby se prozkoumaly neuroprotektivní účinky ochranné látky při tlumení apoptózy vyvolané NaN3 v buňkách PC12 a aby se dodatečně objasnil základní mechanismus.

Poděkování

Není použitelné.

Financování

Tato studie byla finančně podpořena granty National Natural Science Foundation of China (grantno. 81571848) a Priority Academic Program Development ofJiangsu Higher Education Institutions.

Dostupnost dat a materiálů

Soubory dat použité nebo analyzované během tétostudie jsou na přiměřenou žádost dostupné u odpovídajícího autora.

Příspěvky autorů

YZ a SZ studii vymysleli a navrhli. YZ, JH,HX, TG a YW získali data. YZ, JH a HX analyzovali a interpretovali data a vypracovali rukopis. Všichni autoři rukopis kriticky revidovali a přečetli a schválili konečnou verzi rukopisu.

Schválení etiky a souhlas s účastí

Neuplatňuje se.

Souhlas pacienta s publikací