Molekulární klonování je soubor technik používaných k vložení rekombinantní DNA z prokaryotického nebo eukaryotického zdroje do replikujícího se nosiče, jako jsou plazmidy nebo virové vektory. Klonování znamená vytvoření mnoha kopií zajímavého fragmentu DNA, například genu. V tomto videu se dozvíte o jednotlivých krocích molekulárního klonování, o nastavení postupu a o různých aplikacích této techniky.
Před zahájením klonování jsou nutné nejméně dvě důležité molekuly DNA. Za prvé, a to je nejdůležitější, potřebujete fragment DNA, který budete klonovat, jinak známý jako insert. Může pocházet z prokaryota, eukaryota, vyhynulého organismu nebo může být vytvořen uměle v laboratoři. Pomocí molekulárního klonování se můžeme dozvědět více o funkci určitého genu.
Druhé, potřebujete vektor. Vektor je plazmidová DNA, která se používá jako nástroj v molekulární biologii k vytvoření většího počtu kopií nebo k výrobě proteinu z určitého genu. Příkladem vektoru jsou plazmidy, což je kruhová, extrachromozomální DNA, kterou replikují bakterie.
Plazmid má obvykle vícenásobné klonovací místo neboli MCS, tato oblast obsahuje rozpoznávací místa pro různé restrikční endonukleázy známé také jako restrikční enzymy. Různé inzerty lze do plazmidu začlenit technikou zvanou ligace. Plazmidový vektor také obsahuje původ replikace, který umožňuje jeho replikaci v bakteriích. Kromě toho má plazmid gen pro antibiotika. Pokud bakterie inkorporují plazmid, přežijí v médiu, které obsahuje antibiotikum. To umožňuje selekci bakterií, které byly úspěšně transformovány.
Vložka a vektor se klonují do organismu hostitelské buňky, nejčastěji se při molekulárním klonování používá E. coli. E. coli rychle roste, je široce dostupná a komerčně se vyrábí mnoho různých klonovacích vektorů. Jako hostitelské organismy pro vektory lze použít také eukaryota, například kvasinky.
Prvním krokem obecného postupu molekulárního klonování je získání požadovaného inzertu, který lze získat z DNA nebo mRNA z jakéhokoli typu buňky. Optimální vektor a jeho hostitelský organismus se pak vybírají na základě typu inzertu a toho, co se s ním bude nakonec dělat. K replikaci insertu se často používá metoda založená na polymerázové řetězové reakci neboli PCR.
Poté se pomocí řady enzymatických reakcí insert a trávenina spojí a zavedou do hostitelského organismu k hromadné replikaci. Replikované vektory se purifikují z bakterií a po restrikčním trávení se analyzují na gelu. Fragmenty přečištěné na gelu jsou později odeslány k sekvenování, aby se ověřilo, že vložený fragment je požadovaný fragment DNA.
Podívejme se trochu podrobněji na to, jak probíhá molekulární klonování. Než začnete, budete chtít naplánovat strategii klonování, a to ještě předtím, než se pokusíte o klonování na laboratorním stole. Například jakýkoli daný plazmidový vektor vám poskytne konečný počet restrikčních míst pro začlenění inzertu prostřednictvím vícenásobného klonovacího místa. Budete muset zvolit restrikční místa, která se nenacházejí ve vašem insertu, abyste jej nerozštěpili. Mohlo by se stát, že budete nuceni spojit fragment s tupým koncem s fragmentem, který má převis. V takovém případě může být použití klenového fragmentu k vytvoření ligace s tupým koncem vaší jedinou možností, jak dostat insert do požadovaného vektoru. Porozumění různým nástrojům molekulárního klonování, které máte k dispozici, stejně jako vymýšlení pečlivé strategie před zahájením klonování může být obrovskou úsporou času.
Zdroj DNA pro molekulární klonování lze izolovat z téměř jakéhokoli typu vzorku buňky nebo tkáně pomocí jednoduchých extrakčních technik. Po izolaci lze k amplifikaci inzertu použít PCR.
Po amplifikaci inzertu se inzert i vektor natráví restrikčními enzymy, známými také jako restrikční endonukleázy.
Po natrávení lze inzert a vektor spustit na gel a přečistit procesem zvaným gelová purifikace. Co se týče vektoru, tento krok pomůže přečistit linearizovaný plazmid od neříznutého plazmidu, který má tendenci se na gelu jevit jako šmouha o vysoké molekulové hmotnosti.
Po přečištění digesce na gelu se insert liguje neboli spojí s plazmidem, a to pomocí enzymu zvaného DNA ligáza.
Všeobecně platí, že je vždy dobré nastavit ligování tak, aby poměr insertu a vektoru byl 3:1, což zajistí, že se samoligovalo pouze malé množství vektoru. Jakmile je ligace nastavena na ledu, inkubuje se při teplotě 14-25˚C od 1 hodiny do jedné noci.
Následuje transformace, při níž se plazmidový vektor zavede do hostitele, který jej bude replikovat.
Po transformaci se bakterie nanesou na agarové plotny s antibiotikem a inkubují se přes noc při 37 °C. Protože plazmid obsahuje gen rezistence k antibiotikům, úspěšná transformace vytvoří kolonie bakterií při pěstování na agarových plotnách v přítomnosti antibiotik. Jednotlivé kolonie lze poté vybrat z transformované destičky, umístit je do tekutého růstového média v očíslovaných zkumavkách a vložit do třepacího inkubátoru k expanzi. Malý objem tekuté kultury se přidá na očíslovanou agarovou plotnu, zatímco zbytek kultury se přesune k purifikaci plazmidu. Schéma číslování, které označuje identitu bakteriálních kolonií, z nichž budou nakonec purifikovány plazmidy, se zachovává po celou dobu procesu purifikace plazmidů.
Vzorek purifikovaného plazmidu se poté rozřízne restrikčními enzymy. Poté se digest načte a spustí na gelu, aby se zkontrolovala přítomnost insertu, čímž se ověří, že bakteriální kolonie byla transformována plazmidem obsahujícím insert, a nikoli samoligovacím plazmidem. Bakterie, u nichž bylo ověřeno, že byly transformovány s plazmidem obsahujícím insert, se rozšíří pro další purifikaci plazmidu. Sekvenování se používá jako poslední ověřovací krok k potvrzení, že byl klonován gen vašeho zájmu.
Molekulární klonování lze použít pro téměř neomezený počet aplikací. Například když se templát mRNA reverzně transkribuje za vzniku cDNA neboli komplementární DNA enzymem zvaným reverzní transkriptáza a poté se k amplifikaci cDNA použije PCR, lze molekulární klonování použít k vytvoření knihovny cDNA – knihovny všech genů exprimovaných daným typem buňky.
Molekulární klonování lze také použít k tomu, aby se vzala řada genů nebo shluk genů z jednoho bakteriálního kmene, přeorganizovaly se do plazmidů, které se transformují do jiného kmene, takže lze znovu vytvořit celou biosyntetickou dráhu pro výrobu složité molekuly.
Pomocí molekulárního klonování lze vytvořit knihovnu mutantů expresí cílového plazmidu ve speciálním bakteriálním kmeni, který při kultivaci za určitých teplot používá polymerázu náchylnou k chybám. Mutace lze charakterizovat sekvenováním. Bakterie transformované mutantními geny lze poté testovat s různými léčivy nebo chemickými látkami a zjistit, u kterých bakteriálních kolonií se vyvinula rezistence k léčivům.
Díky molekulárnímu klonování lze do plasmidů DNA začlenit reportérové geny, běžným reportérovým genem je zelený fluorescenční protein neboli GFP, který po vystavení UV světlu vyzařuje zelenou fluorescenci. Reportérový gen lze také vložit do alfaviru, aby se ukázala infekce u komárů a přenosnost v buňkách.
Právě jste zhlédli video JoVEs o molekulárním klonování. Nyní byste měli pochopit, jak molekulární klonování funguje a jak lze tuto techniku využít v molekulární biologii. Jako vždy vám děkujeme za sledování!