Navzdory produkci značného množství fosfátu v našich pokusech se nám však nepodařilo zjistit ani spotřebu O2 (pomocí citlivého měření na O2 elektrodě), ani produkci H2O2 (pomocí citlivého křenového peroxidázového testu). Kromě toho byla oxidace Pt pozorována podobnou rychlostí za přísně anaerobních podmínek v pokusech, které zahrnovaly pouze BAP, Pt a vodu. Tyto údaje silně naznačují, že protony pocházející z vody jsou chybějícím akceptorem elektronů pro oxidační reakci Pt a že dalším produktem reakce je pravděpodobně molekulární H2, podle rovnice 2. Na podporu této hypotézy jsme zjistili in vitro i in vivo produkci H2 závislou na Pt. Testy in vitro byly prováděny aerobně v uzavřených lahvičkách za použití vysoce přečištěného BAP. Po inkubaci byl analyzován headspace na H2 a vodný podíl byl analyzován na fosfát. Jak ukazuje obr. 2B , v přítomnosti BAP se z Pt vytvořilo stechiometrické množství fosfátu a H2, zatímco v kontrolních reakcích obsahujících buď samotný BAP, nebo Pt se nevytvořil ani fosfát, ani H2.

Měření H2 in vivo je komplikováno skutečností, že E. coli má více hydrogenáz, které mohou produkovat i spotřebovávat H2. Abychom tento problém obešli, zkonstruovali jsme mutant ΔhypABCDE, který nemůže produkovat žádné aktivní hydrogenázy kvůli neschopnosti dozrát prekurzorové proteiny (32). Mutant hyp, pěstovaný aerobně v uzavřených zkumavkách, produkoval zhruba stechiometrické množství H2 i v kulturách pěstovaných s limitujícími hladinami Pt, zatímco v kulturách pěstovaných s limitujícími hladinami fosfátu nebo esteru fosfoserinu nebyl zjištěn žádný H2 (obr. 2B ).

Oxidace Pt není společným rysem všech alkalických fosfatáz. Účinná oxidace Pt se zdá být jedinečnou vlastností alkalické fosfatázy E. coli. Ani Bacillus subtilis, o kterém je známo, že produkuje více vysoce aktivních fosfatáz (33), ani P. stutzeri, o kterém je známo, že produkuje fosfatázu odlišnou od BAP (u kmenů, které postrádají Pt dehydrogenázový systém) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson a W. W. M., nepublikované údaje), nedokáží využít Pt jako jediný zdroj P (obr. 3A ), ačkoli oba organismy rostou na médiích s fosfoserinem jako jediným zdrojem P (údaje nejsou uvedeny). Fosfatasy produkované těmito organismy tedy nejsou schopny oxidovat Pt v míře dostatečné pro podporu růstu. Testovali jsme také komerční preparáty telecí střevní fosfatázy (CIP) a krevetové alkalické fosfatázy (SAP) na jejich schopnost produkovat fosfát z Pt (obr. 3B ). Ačkoli eukaryotické fosfatázy produkovaly po noční inkubaci malá množství fosfátu, pouze E. coli BAP byla schopna katalyzovat reakci ve významné míře. Toto zjištění je obzvláště překvapivé, protože eukaryotické enzymy jsou ve skutečnosti mnohem lepší fosfatázy, jejichž specifická aktivita je až 40krát vyšší než u BAP (27). Všechny tyto enzymy sdílejí značnou homologii (25-35% identitu) s BAP E. coli; navíc většina zbytků na aktivním místě, včetně Ser-102 (který vytváří kovalentní fosfoenzymový meziprodukt během fosfatázové reakce), je konzervována (27).

Zdá se být pravděpodobné, že oxidaci Pt katalyzuje BAP podobným mechanismem jako při hydrolýze fosfátových esterů (obr. 4A ). V souladu s tím může být Pt hydrolyzován BAP s hydridovým aniontem jako formální odcházející skupinou. Na podporu této myšlenky mutant phoA se zbytkem Ser-102 na aktivním místě změněným na alanin není schopen využívat Pt jako jediný zdroj P, což naznačuje, že tato aminokyselina je nezbytná pro hydrolýzu fosfátových esterů (27) a pro oxidaci Pt (obr. 4B ). Přestože přímý přenos hydridu ze substrátu na vodný proton je z biochemického hlediska bezprecedentní, je tato reakce termodynamicky přiměřená vzhledem k silnému redukčnímu potenciálu páru fosfát-Pt (E o′ = -0,650 V). Reakce produkující H je tedy poměrně příznivá: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (vypočteno z redoxních potenciálů v ref. 34). Pokud se hydrolytický model oxidace Pt ukáže jako správný, jednalo by se o velmi neobvyklou enzymatickou reakci. Studie ukázaly, že BAP je schopen hydrolyzovat také fosfodiestery (35), fosfoamidy (36), sulfátové estery (37) a thiofosfát (38). Tyto reakce však probíhají rychlostí, která je podstatně pomalejší než rychlost reakce hydrolýzy Pt, a to navzdory skutečnosti, že zahrnují mnohem lepší odcházející skupiny. Rovněž se nejedná o redoxní reakce. Analogická reakce zahrnující hydrolýzu alkylfosfonových kyselin není katalyzována BAP, což se ukázalo jak biochemicky (39), tak neschopností kmenů Δphn využívat tyto sloučeniny jako jediný zdroj P (13).

Pt dehydrogenáza (PtxD) byla jediným in vitro charakterizovaným enzymem, u kterého bylo prokázáno, že katalyzuje oxidaci Pt (11). Přestože detaily reakce BAP ještě nebyly objasněny, chemické mechanismy obou enzymů se zřetelně liší. Zatímco PtxD vyžaduje NAD jako akceptor elektronů pro redoxní reakci, reakce katalyzovaná BAP nevyžaduje žádné exogenní akceptory elektronů, ale využívá velké termodynamické hnací síly reakce k produkci vysoce redukovaného produktu (H2) z vody v podstatě nevratnou reakcí (vypočtené K eq = 1,1 × 108). Všechny ostatní známé reakce produkující H2 probíhají mnohem blíže chemické rovnováze a jsou obvykle vratné. Navíc všechny ostatní známé hydrogenasy obsahují ve svých aktivních místech buď Fe, nebo Ni, nebo obojí (40). Toto pozorování zahrnuje i takzvanou „bezkovovou“ H2-tvořící methylen tetrahydromethanopterin dehydrogenázu methanogenních archeí, o které je nyní známo, že obsahuje i Fe (41). Naproti tomu BAP neobsahuje žádné redoxně aktivní kovy, ačkoli Zn i Mg jsou pro hydrolytickou aktivitu nezbytné (27). Ošetření BAP chelátory inhibuje oxidaci Pt, což naznačuje, že kovy hrají v reakci Pt určitou roli (údaje nejsou uvedeny).

Koneckonců, zde uvedené údaje in vivo naznačují, že oxidační reakce Pt je biologicky relevantní. Pozorování, že mnoho bakterií má enzymy určené k oxidaci Pt, ukazuje, že tato vlastnost je v mikrobiálních populacích pod silným selekčním tlakem (4, 5, 9, 42). S ohledem na tuto skutečnost je zajímavé, že ačkoli jsou eukaryotické enzymy mnohem lepšími fosfatázami, nejsou schopny oxidace Pt. Toto pozorování vyvolává možnost, že BAP E. coli se možná nevyvinula jako nejúčinnější fosfatáza, ale spíše jako fosfatáza se schopností hydrolyzovat Pt. Tato myšlenka je v souladu se zajímavým pozorováním, že E. coli BAP je velmi silně exprimována (až 6 % celkového buněčného proteinu) za podmínek fosfátového hladovění (28). Tradičním vysvětlením tohoto jevu je, že nějaký neznámý substrát BAP musí být špatně hydrolyzovatelný, a proto vyžaduje obrovské množství enzymu, aby podpořil konkurenceschopnou rychlost růstu. Protože se však naměřené rychlosti hydrolýzy u široké škály substrátů fosfátových esterů příliš neliší (39, 43), zdá se nepravděpodobné, že by tímto špatným substrátem mohl být fosfátový ester. Naproti tomu rychlost hydrolýzy Pt je podstatně nižší než rychlost hydrolýzy fosfátových esterů, což naznačuje, že Pt může být substrátem, který vysvětluje extrémní úroveň exprese phoA pozorovanou u E. coli s nedostatkem fosfátů.

Je zřejmé, že mnoho detailů reakce BAP s Pt zbývá objasnit. Další studium této unikátní reakce pravděpodobně přispěje nejen k našemu pochopení redoxní chemie P a reakcí přenosu fosforylu, ale také k našim znalostem o přenosu hydridů, reakcích produkujících H2 a úloze redukovaných sloučenin P v přírodě.