Výzkumné studie

V našich studiích jsme zkoumali jednu plodinu EU, Pisum sativum (hrách). Hrách je náchylný k celé řadě virů, včetně viru mozaiky hrachu (Pea enation mosaic virus), viru raného hnědnutí hrachu (Pea early browning virus) a řady virů ze skupiny Potato virus Y (Potyviridae). V rámci této poslední skupiny jsou významnými patogeny virus žluté mozaiky fazolu, virus běžné mozaiky fazolu, virus mozaiky hrachu a virus mozaiky přenášené semeny hrachu (PSbMV). Zejména jsme studovali PSbMV, ke kterému jsou náchylné všechny komerční odrůdy hrachu. Tato náchylnost je umocněna skutečností, že tento virus se nejen přenáší z rostliny na rostlinu prostřednictvím svého přenašeče mšice, ale přenáší se také vertikálně z generace na generaci v osivu. Tato vlastnost vedla k závažné kontaminaci sbírek zárodečné plazmy hrachu a poskytuje velmi účinný prostředek k časné a rozsáhlé infekci plodin brzy po vyklíčení semen. Vezměme v úvahu, že účinnost přenosu osiva pouhých 0,1 % by vedla k 10 000 infekcím po výsevu 107 semen na hektar, a význam přenosu osiva je zřejmý. V současné době se tomuto problému čelí účinným testováním vzorků osiva po sklizni pomocí imunodetekce bílkoviny virového pláště a vyřazováním kontaminovaných partií osiva. Vzhledem k tomu, že přenos viru na osivo se u řady odrůd hrachu pohybuje od 0 do 100 %, zkoumali jsme, zda by bylo možné vyšlechtit odolnost vůči přenosu viru na osivo u zlepšených linií hrachu. V testovacích kříženích a zpětných kříženích mezi liniemi nevykazujícími žádný přenos nebo 60-80% přenos se odolnost chovala jako dominantní znak, ačkoli v generacích F2 a BC2 se nesegregovala jako mendelovský znak. Kvantitativní povaha fenotypu naznačuje, že přenos na semeno by bylo obtížné zařadit jako znak rezistence do konvenčního šlechtitelského programu.

Přirozená rezistence k PSbMV byla identifikována u odrůd hrachu ze severní Afriky a Asie, ačkoli doposud nebyly tyto recesivní geny introgresovány do komerčních linií. Genetická analýza ukázala, že tyto geny jsou seskupeny s dalšími recesivními geny s různou specifitou pro virus poty na dvou místech genomu hrachu. Geny sbm-1, sbm-3 a sbm-4, které propůjčují odolnost vůči patotypům PSbMV PI, L-l a P4, se nacházejí na chromozomu 6, zatímco gen sbm-2, který rovněž propůjčuje odolnost vůči patotypu L-l, se nachází na chromozomu 2 . Ačkoli toto uspořádání naznačuje lokální přeměnu genů a translokaci mezi chromozomy 2 a 6, další důkazy naznačují, že tyto dva shluky genů mohou mít odlišný původ a funkci. Pomocí rekombinantních hybridních virů vyrobených mezi různými patotypy byl determinant avirulence viru definován jako protein spojený s genomem viru (VPg) pro sbm-1 . Strukturní a funkční analýza genu sbm-1 je předmětem projektu EC-Biotechnology # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv), na kterém se podílejí výzkumné skupiny a průmysl z Dánska, Finska, Španělska a Spojeného království.

Charakterizace genu sbm-1 přinese zvláštní intelektuální a praktické výhody. Vzhledem k tomu, že přibližně 20 % všech genů pro rezistenci k virům a přibližně 40 % genů propůjčujících rezistenci k potyvirům je recesivních , bude pochopení toho, jak sbm-1 funguje a co řídí specifičnost sousedních genů pro rezistenci k sbm- a dalším potyvirům, důležité pro celou řadu chorob. Projekt sbm- se však potýká také s technickými problémy, v neposlední řadě s nutností vypořádat se s velikostí a redundancí v genomu hrachu. Genom hrachu má přibližně 5 x 109 párů bází na haploidní genom, což je asi 50krát více než genom Arabidopsis thaliana. Klonování genů v hrachu na základě mapy se zatím nepodařilo a velké knihovny insertů zatím nejsou k dispozici. V sbm-1 však existuje potenciál pro identifikaci nové třídy genů rezistence. Dosud klonované geny rezistence z jiných druhů se dělí do dvou tříd. Dominantní geny rezistence, které fungují proti specifickým virům, houbám a bakteriím, spadají obecně do třídy „NBS-LRR“ a zprostředkovávají hypersenzitivní rezistenci vůči infekci. Jediný recesivní gen, který se podařilo naklonovat (mlo), zprostředkovává nerasově specifickou odolnost vůči moučnivce ječmene a je rovněž spojen s lokalizací patogenu v mrtvých buňkách. Funkčně působí mlo jako negativní regulátor konstitutivní rezistence . Naproti tomu sbm-1 je rasově (nebo patotypově) specifický a není spojen se smrtí buněk. Z těchto srovnání se zdá být možných několik funkčních mechanismů pro sbm-1. Zaprvé můžeme Sbm-1 považovat za dominantní faktor vnímavosti, který je nutný k podpoře replikace viru. To by odpovídalo pravděpodobnému zapojení VPg do replikace virové RNA a pozorování, že protoplasty z rezistentních rostlin nevykazují žádnou detekovatelnou replikaci viru . Za druhé, stejně jako Mlo by Sbm-1 mohl působit jako negativní regulátor rezistence, ačkoli rozdíly ve specifičnosti oproti mlo by sbm-1 řadily do odlišné třídy genů rezistence. Za třetí, sbm-1 by mohl být dominantní, ale na dávce závislou slabou alelou rezistence. Upřednostňujeme první možnost jako nejpřímější a nejjednodušší interpretaci.

Pro naši složku v projektu EC-Biotechnology jsme se rozhodli použít genetické přístupy k identifikaci produktu genu sbm-1 pro rezistenci. Po identifikaci vhodných linií hrachu (pár linií BC4 nesoucí homozygotní alely rezistence a náchylnosti) byla použita strategie cDNA-AFLP k identifikaci exprimovaných genů pocházejících z introgrované oblasti. Dosud bylo identifikováno deset polymorfních cDNA. Ty se mapují pomocí rekombinantních inbredních rodin, aby se potvrdil jejich genomický původ. Naší alternativní strategií je „lovit“ produkt genu sbm-1 pomocí kvasinkového dvouhybridního systému s PSbMV VPg jako návnadovým proteinem. Z knihovny cDNA hrachu vytvořené z náchylné linie hrachu byly identifikovány dvě silné kandidátní cDNA a osm dalších cDNA kódujících interaktorové proteiny. Tyto cDNA jsou rovněž sekvenovány a mapovány.

V rámci předchozího projektu EC-AIR (# CT94-1171), na kterém se podíleli akademičtí a průmysloví partneři z Dánska, Francie a Spojeného království, jsme rovněž zkoumali možnosti vývoje PDR vůči PSbMV u transgenního hrachu. Vzhledem k tomu, že v jiných systémech se k poskytnutí PDR běžně používal gen virové replikázy spuštěním procesu posttranskripčního umlčování genů (PTGS), použili jsme pro transgenní expresi v hrachu cistron PSbMV replikázy (NIb) . Z 35 linií hrachu transformovaných pomocí Agrobacterium tumefaciens T- DNA nesoucí konstrukt 35S promotor -Nib – 35S terminátor a gen bar jako selekční marker pro transformovaná pletiva v přítomnosti herbicidu Bialophos se tři linie ukázaly být rezistentní vůči PSbMV. Dvě z těchto linií nesly přímé opakování 3′ konce genu Nib (NIbIb), protože existovaly určité důkazy, že složité uspořádání transgenů má větší potenciál iniciovat PTGS. Všechny tyto linie vykazovaly typ PDR označovaný jako „zotavení“, kdy inokulace výzvou vede k počáteční infekci, ale rostliny se rychle zotaví a nevykazují žádné další příznaky ani akumulaci viru. Zotavená pletiva jsou pak odolná vůči dalšímu napadení homologními nebo blízce příbuznými izoláty viru. Pro posouzení významu této skutečnosti na poli, kde mohou být rostliny napadeny populací příbuzných virů, byla hodnocena schopnost různých izolátů PSbMV vyvolat PTGS a být cílem indukované PTGS. To ukázalo, že viry s přibližně 89% nebo větší shodou v cistronu NIb mohou vyvolat rezistenci, ačkoli požadavky na specifičnost, aby byl druhý napadený virus považován za cíl, mohou být vyšší. Pro srovnání, dva nejodlišnější sekvenované izoláty PSbMV se v oblasti Nib liší o 89 %. Tento rozdíl v požadavcích na specifičnost pro spouštění a cílení v PTGS bude důležitým faktorem pro použití této technologie u komerčních plodin. Relativně široká rezistence k izolátům PSbMV u transgenního hrachu Nib kontrastuje s extrémní patotypovou specifitou pozorovanou u přirozených genů rezistence sbm, kde stačí pouze jedna nebo několik málo změn v determinantě avirulence viru, aby se izolát PSbMV změnil z avirulentního na virulentní .

I přes krátkou dobu počáteční infekce vykazovaly transgenní rostliny hrachu po inokulaci výzvou dobrý růst a nasazení semen, aby poskytly výnosy ve skleníkových podmínkách rovnocenné výnosům pozorovaným u neinfikovaných transgenních nebo netransgenních linií. Domníváme se, že s výhradou licenčních dohod vztahujících se na použití genu bar pro výběr transformovaných rostlin by tyto rostliny mohly být užitečným doplňkem panelu genů rezistence k patogenům, který bude použit při vývoji nových vylepšených linií hrachu.

Transgenní rostliny hrachu představují první luštěniny vykazující PDR proti potyvirům a jedny z prvních experimentálních příkladů rostlin vykazujících PTGS u Leguminosae. Bylo proto cenné zjistit, že principy řídící PTGS a odolnost v tomto systému podporují principy charakterizované u běžněji používaných experimentálních rostlin (např. Nicotiana spp.). Jak se u PTGS očekávalo, indukovaná odolnost vůči virům byla spojena s degradací transgenové RNA a RNA PSbMV . Ukázali jsme také, že PTGS byla v těchto rostlinách zprostředkována systémovým signálem generovaným během počáteční fáze virové infekce a že tento signál měl potenciál zprostředkovat šíření PTGS indukcí metylace v transkribované oblasti transgenu NIb .

Závěrem jsme uznali, že pro zemědělský průmysl by bylo výhodné mít stabilní a účinnou rezistenci vůči PSbMV v hrachu. Nejméně spornou cestou k dosažení tohoto cíle by bylo začlenění přirozeně se vyskytující rezistence (buď k přenosu ze semen, nebo k replikaci viru) pomocí konvenčních šlechtitelských strategií. Naše poměrně špatné znalosti genetické složitosti přenosu PSbMV semeny znamenají, že to v krátkodobém horizontu pravděpodobně nebude užitečné. Geny sbm- jsou slibnější, i když nedostatek úzce propojených genetických markerů a recesivní povaha rezistence působí určité potíže. Alternativně jsme prokázali potenciál pro vytvoření rezistence pomocí transgenní technologie, i když bude třeba vyřešit otázky biologické bezpečnosti a přijatelnosti pro veřejnost. Kromě těchto aplikovaných úvah výzkum přinesl a přináší materiály a poznatky, které ovlivní způsob využití příbuzných přístupů u jiných plodin. Důležité bude zejména pochopení mechanismů působení nové třídy genů odolnosti vůči virům

.