Diskuse

Předkládaná studie identifikovala řadu odlišných vlastností kolaterálních EC a SMC, které mohou být základem nebo přispívat k jedinečným vlastnostem kolaterál popsaným v úvodu. Zjistili jsme, že navzdory nízkému a oscilačnímu smykovému napětí přítomnému v kolaterálách na výchozím stavu při absenci obstrukce jsou jejich EC zarovnány s osou cévy ve stejné míře, jaká je přítomna v distálnějších arteriolách a v sestupné aortě – cévách s ortográdním laminárním prouděním o vysoké rychlosti. Endotelové buňky kolaterál i arteriol mají primární řasinky, kolaterály jich mají méně. Hladké svalové buňky kolaterál jsou na rozdíl od buněk DMA kontinuální. Kolaterály mají ve srovnání s DMA vyšší hladiny exprese genů spojených s pro- i protizánětlivými a pro- i protiproliferačními drahami. Příklon k vyšší míře buněčné proliferace v muralních buňkách kolaterál podporuje pozorování, že kolaterály začínají krátce po svém vzniku v embryu získávat tortuozitu, která se zvyšuje až do středního věku (16 měsíců, ekvivalent 49 lidských let ). Výše uvedená zjištění poskytují vhled do strukturálních a molekulárních specializací, které mohou být základem jedinečných vlastností a funkcí kolaterálních cév.

Konvergence průtoku krve v kolaterálách na počátku působí na jejich muralní buňky nízkými a „narušenými“ silami průtoku/smykového napětí, tj. buď nepřítomností průtoku, nebo velmi nízkým průtokem, který osciluje sem a tam (~1-10krát za minutu) a v průměru je nulový . To má za následek zvýšené napětí stěn podle Bernoulliho vztahu. Pokud je přítomno jinde v arteriální cirkulaci, např. na bifurkacích, vnitřním oblouku aorty nebo za plaky, nízké a narušené smykové napětí upřednostňuje neuspořádanou dlaždicovou morfologii EC, která je spojena se zvýšeným oxidačním stresem, zánětem, markery stárnutí a nízkou aktivitou eNOS/NO (tj. endoteliální dysfunkcí) . Překvapivě jsme však zjistili, že kolaterální EC mají stejné zarovnání (a rozměry buněk) jako EC v DMA a v sestupné aortě. Nezkoumali jsme, jak je tento protizánětlivý strukturální fenotyp specifikován. Je možné, že se na tom podílí jeden nebo více dalších jedinečných znaků, které jsme identifikovali (viz níže). Na druhou stranu údaje na obrázku 2 týkající se průtoku a smykového napětí byly získány u anestetizovaných zvířat. Během bdělého stavu mohou mít kolaterály období trvalého průtoku v jednom nebo druhém směru vyvolané změnami regionální metabolické aktivity v území zásobovaném arteriálními stromy, které kříží. Není známo, zda kolaterály tímto způsobem přispívají k fyziologické metabolické regulaci průtoku krve a dodávky kyslíku, tj. k neurovaskulárnímu spojení v mozku a funkční hyperemii jinde. Taková období trvalého jednosměrného průtoku by však mohla podporovat námi pozorovanou orientaci EC. Bez ohledu na základní příčinu spekulujeme, že vyrovnaný fenotyp kolaterálních EC je součástí (nebo markerem) skupiny ochranných mechanismů, které podporují udržení kolaterál a zmírňují jejich řídnutí (obr. 9).

Podle našich znalostí se jedná o první zprávu, která ukazuje, že EC vystýlající kolaterály a arterioly mají primární řasinky. Jsou mnohem hojnější, než se dříve uvádělo u konduitálních cév zdravých jedinců (tj. chyběly nebo byly přítomny na méně než 1 % EC ): 18 % EC kolaterál má PrC ve srovnání s 28 % u DMA. Primární řasinky na ECs popsal v roce 1984 Haust v aortě králíků a lidí s aterosklerózou . Následné zprávy popsaly řasinky v kapilárách epifýzy 20týdenního lidského plodu , ve vyvíjejícím se srdci a v lístcích aortální chlopně , a odkazy tamtéž], v okolí ateromů , ektopicky ve společné krkavici ApoE-/- myší a u zdravých jedinců v bifurkacích konduitálních tepen a ve vnitřním zakřivení aortálního oblouku; naproti tomu řasinky chybí nebo téměř chybí v oblastech tepen, kde je smykové napětí laminární . Většina ostatních typů buněk exprimuje PrC během vývoje, za určitých podmínek buněčné kultury a v dospělosti . V závislosti na typu buňky se PrC podílejí na specifikaci asymetrie embrya, rozmístění centriol, regulaci proliferace/buněčného cyklu, autofagii, mechanotransdukci vnímající proudění, chemocepci a kompartmentalizaci a přenosu signálních proteinů mezi řasinkami, cytoplazmou a jádrem (např. pro Gli a PDGFRα) . Pokud jsou řasinky přítomny, jsou nejhojněji zastoupeny v neproliferujících buňkách, přičemž jejich proximální konec je ukotven v invaginaci plazmalemy (ciliární kapsa) v EC a dalších, ale ne všech typech buněk . Primární řasinky jsou zkomplexovány s mateřskou centriolou bazálního tělíska, která se napojuje na mikrotubulární organizační centrum (MTOC) . Rozložení/resorpce řasinky během S-fáze a uvolnění centriol jsou nezbytné pro buněčné dělení . Vzhledem k tomu, že PrC jsou spojeny s cytoskeletem prostřednictvím MTOC, je prouděním indukované ohýbání řasinek v EC schopno přenášet se do celé buňky, včetně spojů mezi buňkami a buněčnou matrix . Primární řasinky přenášejí smykové napětí v ledvinových tubulárních epiteliálních buňkách a ECs cestou, která je mimořádně citlivá na smykové napětí a zahrnuje polycystin-1 a polycystin-2, které jsou kódovány Pkd1 a Pkd2 . Polycystin-1 má mechanosenzitivní vlastnosti, zatímco polycystin-2 je kalciový kanál TRP. Oba proteiny jsou nezbytné pro vnímání smykového napětí a následné uvolňování oxidu dusnatého . Defekty v PrC jsou spojeny s mnoha abnormalitami. Například mutace PKD1 a PKD2 jsou příčinou autozomálně dominantní polycystické choroby ledvin, přičemž EC a tubulární buňky ledvin pacientů vykazují nedostatečnou reakci na vápník a NO a zvýšenou proliferaci .

Primární řasinky chybí v EC lidské pupečníkové žíly udržovaných při laminárním smykovém stresu a proliferačním klidu v buněčné kultuře. V lidských pupečníkových žilách má méně než jedno procento EC řasinky, které vyčnívají do lumen, zatímco u větší části jsou řasinky umístěny intracelulárně . Embryonální aorta a z ní kultivované EC mají jediné řasinky, které vyčnívají do lumen . Endoteliální řasinky jsou přítomny v oblastech s vysokým smykovým stresem během embryonálního vývoje spolu s expresí transkripčního faktoru KLF2 citlivého na smykový stres, který transaktivuje eNOS a další protizánětlivé a antiproliferativní geny . V oblastech s nízkým nebo narušeným smykovým stresem jsou PrC rozloženy/chybí a exprese Klf2 a eNOS je zrušena, respektive snížena . Exprese Klf2 je rovněž potlačena v nesestavených EC izolovaných z embryonálních tepen a chemické odstranění PrC z EC v kultuře má podobný účinek, tj. zrušení exprese Klf2 . Zajímavé je, že v EC dospělých ApoE-/- myší, které mají endoteliální dysfunkci, ale nedochází u nich k rozvoji plaků, jsou řasinky ve společné krční tepně exprimovány ektopicky i přes přítomnost laminárního proudění, ve srovnání s divokým typem myší, které řasinky postrádají . Řasinky se ztratily, když bylo vyvoláno vysoké smykové napětí pomocí implantace sádry omezující průtok kolem cévy. Odlitek společné krkavice u myší divokého typu vyvolal řasinkotvorbu pouze v oblastech s nízkým a narušeným smykovým napětím. Tato zjištění naznačují, že exprese PrC na EC in vivo u dospělých jedinců je omezena na oblasti s nízkým/porušeným smykovým napětím, ale může se vyskytovat ektopicky v tepnách s laminárním průtokem za přítomnosti endoteliální dysfunkce způsobené hyperlipidémií a případně dalšími cévními rizikovými faktory. Za zmínku stojí, že v oblastech s vysokou řasinkou a narušeným tokem, jako je vnitřní zakřivení aortálního oblouku nebo za plaky, má přibližně 25 % EC jediné řasinky, zatímco zbytek je bez nich , což je podobné procento, jaké jsme pozorovali u arteriol a kolaterál.

Naše zjištění, že PrC jsou přítomny také na arteriolách a kolaterálách u zdravých mladých dospělých myší, zdůrazňují potřebu studií zkoumajících funkci řasinek v těchto typech cév. To zahrnuje určení, zda má naše pozorování menšího počtu řasinek na kolaterálních EC než na arteriolách funkční význam. Endotelové buňky jsou mechanicky, elektricky a difuzně propojeny s přilehlými EC a SMC , takže k přenosu mechanicky citlivých nebo jiných signálů může být zapotřebí, aby řasinky exprimovala pouze část EC. Vysoké smykové napětí způsobuje rozpad řasinek v kultivovaných EC, zatímco oscilační změna průtoku vyvolává jejich expresi . Předpokládáme, že řasinky na arteriolách a kolaterálních EC mohou odrážet nižší průtok/smykové napětí v arteriolách a velmi nízký a narušený průtok v kolaterálách a že menší počet PrC na kolaterálních EC může sloužit ke snížení jejich citlivosti na převládající narušené prostředí smykového napětí. Jinými slovy, menší počet řasinek na kolaterálních EC může být součástí repertoáru adaptací, které vyvažují nebo brání – prostřednictvím udržované nebo zvýšené exprese KLF2/4, eNOS a dalších protizánětlivých/protiproliferačních faktorů – nízkému stupni zánětlivých, oxidačních, proliferačních a apoptotických signálů podporovaných narušeným hemodynamickým prostředím přítomným v kolaterálách (obr. 9). Egorova et al. navrhli něco podobného, tj. že vzhledem k tomu, že přítomnost PrC na EC je spojena s expresí KLF2, mohou endoteliální řasy signalizovat brzdu aktivace EC v oblastech nízkého a narušeného průtoku. Ochrannou roli řasinek v těchto oblastech podporuje nedávná zpráva, že odstranění endotelových řasinek pomocí podmíněné delece Ift88 zvýšilo expresi aterosklerózy a zánětlivých genů a snížilo aktivitu eNOS u Apoe-/- myší krmených dietou s vysokým obsahem tuků , a že endotel se stává v oblastech náchylných k ateroskleróze senzitivním k osteogenní diferenciaci u myší s defektem řasinek Tg737 (orpk/orpk) . Je také možné, že pokud jsou PrC protektivní, jejich menší množství v kolaterálách by mohlo přispívat k vysoké náchylnosti těchto cév k řídnutí vlivem stárnutí a dalších cévních rizikových faktorů. Menší počet řasinek v kolaterálách však může odrážet pouze sekundární nebo vedlejší účinek, který je například důsledkem vyšší vrozené míry proliferace kolaterálních EC, o čemž svědčí postupné zvyšování tortuozity kolaterál (popsáno níže), protože se předpokládá, že přítomnost PrC a jejich spojení s bazálním tělískem podporuje vyřazování buněk z buněčného cyklu . Budoucí studie budou nutné ke zjištění, zda náš nález mnohočetných řasinek na EC odráží EC, které prošly proliferační senescencí a související neúspěšnou cytokinezí a jadernou polyploidií .

Nedávno bylo prokázáno, že EC ve vyvíjející se myší sítnici spoléhají na PrC při stabilizaci cévních spojení během remodelace cévního plexu v oblastech s nízkým až středním smykovým napětím . Endoteliální řasinky vnímají proudění u embryí zebřiček, podílejí se na náboru muralních buněk do arteriálních osudových cév a jsou nezbytné pro normální morfogenezi cév . Počet a průměr kolaterál klesá počínaje středním věkem . Toto řídnutí způsobené věkem je silně urychleno genetickým nebo farmakologicky navozeným nedostatkem eNOS/NO nebo přítomností cévních rizikových faktorů . Zvýšené smykové napětí vyvolává remodelaci kolaterál směrem ven po akutní nebo pomalu se rozvíjející arteriální obstrukci . Pkd1+/- myši a pacienti s autozomálně dominantní polycystickou chorobou ledvin mají endoteliální dysfunkci eNOS/NO . V budoucích studiích bude důležité prozkoumat, zda se kolaterální PrC podílejí na jedné nebo více z výše uvedených funkcí pomocí EC specifického knockdownu polycystinu-1, protože : 1) jeho nedostatek vede ke změně ciliární funkce, 2) polycystin-1 se spolu s polycystinem-2 podílí na snímání průtoku PrC, 3) mutantní formy obou proteinů způsobují polycystické onemocnění ledvin , 4) existují důkazy, že VHL, nezávisle na své roli v degradaci Hif1α, spolu s GSK3β jsou nezbytné pro strukturální údržbu řasinky a 5) protein Rabep2, který je nezbytný pro kolaterogenezi , je novým substrátem GSK3β , lokalizuje se v komplexu řasinka-bazální tělísko a jeho knockdown vede k defektní ciliogenezi . Bude třeba prozkoumat i další přístupy k zásahu do přítomnosti a funkce řasinek, např. pomocí knockdownu dalších řasinkových proteinů, jako jsou Pkd2 a Ift88.

Na rozdíl od distálních arteriol, které mají řídké a nesouvislé SMC v různých tkáních včetně sítnice (studie v mozku se nám nepodařilo identifikovat) , byly SMC na kolaterálách souvislé. Předpokládáme, že se může jednat o adaptivní zvětšení tloušťky stěny, které má vyvážit zvýšení obvodového napětí stěny způsobené Bernoulliho specifikovanou konverzí kinetické energie proudění na zvýšenou potenciální energii (transmurální tlak) v důsledku konvergence proudění v kolaterálách. Bylo by zajímavé zjistit, zda se složení a množství extracelulární matrix, která by mohla SMC pomáhat vyrovnávat zvýšené napětí stěny v kolaterálách, liší v kolaterálách oproti arteriolám. Za zmínku stojí, že navzdory zvýšenému pokrytí SMC mají kolaterály ve srovnání s podobně velkými arteriolami spíše menší než větší tonus a postrádají myogenní reaktivitu – další jedinečné rysy kolaterálních cév .

Narušené hemodynamické, prooxidační prostředí, v němž kolaterální muralní buňky pobývají, nás vedlo ke zkoumání, zda se exprese genů zapojených do zánětu, buněčné proliferace, stárnutí a angiogeneze liší u kolaterál oproti distálním arteriolám. Kolaterály vykazovaly zvýšené hladiny mRNA pro prozánětlivý, proapoptózový inflammasomový gen Pycard, proproliferační geny Ki67, Pdgfb a Angpt2, antiproliferační gen Dll4 a diferencovaný markerový gen EC arteriálního typu Ephrinb2. Exprese genů inhibitorů buněčného cyklu, p21, p27 a p53, se však nelišila, stejně jako exprese dalších genů spojených s proliferací, zástavou buněčného cyklu a stárnutím (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomeráza). Rozdíly nebyly ani v expresi dalších genů spojených s proliferací EC a/nebo SMC (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) a které jsou nezbytné (v případě prvních tří genů ) pro tvorbu kolaterál během vývoje nebo se podílejí na specifikaci diferenciace a klidového stavu EC a SMC (Tgfb, Angpt1). Zvýšená exprese výše uvedených proproliferačních genů kolaterálami je v souladu s našimi měřeními tortuozity, která naznačují, že kolaterální muralní buňky mají ve srovnání s ostatními arteriálními cévami vyšší míru proliferace: tortuozita kolaterál byla patrná již první den po narození, zvyšovala se až do středního věku a poté klesala. K tomu došlo ve stejné době, kdy u kolaterál dochází k poklesu počtu a průměru s pokročilým stárnutím . Tato zjištění podporují hypotézu, že řídnutí kolaterál spojené s věkem je způsobeno proliferační senescencí a následnou apoptózou kolaterálních EC a SMC v důsledku celoživotně zvýšené rychlosti proliferace způsobené narušenou hemodinamikou a nízkým obsahem kyslíku v krvi, v níž se kolaterály nacházejí (obr. 9).

Kolaterály také vykazovaly zvýšenou aktivitu eNOS, která podle předchozích studií působí proti řídnutí kolaterál způsobenému stárnutím a dalšími rizikovými faktory cévního systému . eNOS odvozený NO inhibuje oxidační stres, zánět, proliferaci, adhezi leukocytů, agregaci destiček a stárnutí buněk a podporuje relaxaci SMC . Vzhledem k tomu, že smykové napětí je proximátním stimulem pro NO odvozený od eNOS, může zvýšené množství eNOS/NO v kolaterálách s jejich nízkým a narušeným prostředím smykového napětí snižovat účinek faktorů podporujících řídnutí kolaterál (obr. 9). Podobně udržovaná exprese transkripčních faktorů Klf2 a Klf4 citlivých na smykové napětí v EK v kolaterálách navzdory jejich nízkému a oscilačnímu průtoku, který inhibuje expresi těchto faktorů jinde v arteriální vaskulatuře s narušeným průtokem , může působit jako další „vyvažující“ faktory nebo specializace kolaterál spolu se zvýšenou eNOS, vyrovnanými EK, menším počtem řasinek, robustním pokrytím SMC a zvýšeným množstvím efrinu-B2 a Dll4. Exprese KLF2 a KLF4, které negativně regulují proliferaci, zánět a angiogenezi, upregulují eNOS a jsou prudce sníženy v místech nízkého a narušeného smykového napětí, se v kolaterálách oproti DMA nelišila. Zajímavé je, že PrC podporují expresi Klf2, Klf4 a eNOS .

Omezením výše uvedených studií je, že RNA byla získána z disekovaných cév, které jsou složeny z EC, SMC a, i když méně, pericytů, fibroblastů a rezidentních myeloidních buněk. Je zapotřebí studií, které by využívaly separaci buněčných typů a zkoumání širšího spektra genů a jejich příslušných hladin proteinů. Obtížnost manuální disekce kolaterál a distálních arteriol v potřebném počtu, vliv technik buněčné disociace na základní hladiny RNA a proteinů, neexistence modelů buněčných kultur „kolaterálních“ EC a SMC a zatím neexistence jakéhokoli kolaterálně specifického markerového genu však použití těchto přístupů vylučují. Za zmínku však stojí, že exprese několika zkoumaných genů je specifická nebo obohacená pro EC, např. Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 a Klf4. Analýza genové transkripce však ne vždy odráží změny v úrovni nebo funkci proteinů; proto může zkoumání markerů oxidačního stresu, zánětu, proliferace nebo senescence na úrovni proteinů lépe odrážet rozdíly v buněčných charakteristikách.

.