Úvod

Část slunečního záření dopadajícího na zem zahrnuje ultrafialové spektrum sestávající ze tří částí UVC (200-290 nm), UVB (290-320 nm) a UVA (320-400 nm). UVC je zcela pohlceno zemskou atmosférou. Množství UVA, které dopadá na zem, je více než dvacetkrát vyšší než množství UVB.1 UVA hraje hlavní roli v předčasném stárnutí a fotokarcinogenezi. UVA zvyšuje uvolňování zánětlivých faktorů, včetně IL10 z buněk keratinocytů. Kromě toho zvyšuje expresi zánětlivých proteinů, jako jsou TNFα, IL1α, IL6 a IL8.2,3 UVA hraje významnou roli při vzniku mutací v mitochondriální DNA v lidské kůži pomocí ROS (reaktivních kyslíkových koření). Způsobuje také předčasné stárnutí kůže tím, že vytváří mutace v buňkách fibroblastů v lidské kůži.4 Úloha zvýšené exprese proteinu p53 při způsobování apoptózy vyvolané UVA je nepopiratelná.5 Cenným indikátorem pro sledování oxidačního poškození DNA způsobeného UVA je 8-hydroxy-2′-deoxyguanin (8-oxoG), který může vést k transverzím G → T.6

Proto je ochrana proti UVA spolu s UVB velmi důležitá.

Ochranný faktor UVA (UVA-PF) se používá k hodnocení účinnosti opalovacích přípravků proti UVA záření.

Materiál a metody

V této studii byly přezkoumány a porovnány světové standardy v oblasti stanovení UVA-PF. Čtyři normy, a to ISO 24443 (poskytnutá Evropskou unií v květnu 2013), CEN2006 (poskytnutá Evropskou unií, Jihoafrickou republikou a Japonskem v Bruselu 12. července 2006), FDA 2007 (poskytnutá Spojenými státy americkými 27. srpna 2007) a FDA 2011 (poskytnutá Spojenými státy americkými 17. června 2011), stanovily různé protokoly v oblasti ochranného faktoru UVA. Některé se zabývají metodami in vivo, zatímco jiné metodami in vitro.7-11

Výsledky

Vzhledem k roli UVA při vzniku poškození kůže je důležité používat opalovací krémy, které chrání kůži před UVA i UVB. Metody měření UVA-PF in vitro nejsou spolehlivé a reprodukovatelné vzhledem k rozdílům ve zkušebních podmínkách, jako je rozlišení substrátů, variantní množství aplikovaného přípravku a dávka UV záření.12 Mezi normami FDA 2007 a CEN, které zavádějí metodu PPD in vivo, mají obě své výhody a nevýhody, takže použití lepšího přístupu v každém případě může přinést lepší výsledky.

Diskuse

Vyhodnocení zkoušky stanovení UVA-PF in vivo

Nejprve projdeme metody stanovení UVA-PF in vivo prováděné pomocí okamžitého ztmavnutí pigmentu (IPD), trvalého ztmavnutí pigmentu (PPD) a ochranného faktoru A (PFA). V normách CEN a FDA z roku 2007 je však metoda PPD akceptována pouze u metody stanovení UVA-PF in vivo (tabulka 1).

Tabulka 1 Srovnání protokolů stanovení UVA-PF in vivo

V metodě PPD jsou stejně jako v metodě měření SPF (ochranného faktoru proti slunečnímu záření) vybrány osoby splňující kritéria pro test s určeným počtem pro účast. V testu SPF je koncovým bodem erytémová reakce oproti testu PPD, v němž je koncovým bodem přetrvávající pigmentové ztmavnutí testovaných dílčích míst. Testovací místa a dílčí místa jsou navržena ve specifických rozměrech naslepo na tělech účastníků. Testovaný a referenční opalovací přípravek se zváží v definovaném množství a nanese se na kůži účastníka. Poté se specifickou metodou výrobek rozetře po pokožce a následuje doba čekání na zaschnutí výrobku. Osoby jsou na základě předem stanoveného způsobu vystaveny UVA záření vsedě nebo vleže na břiše. Po uplynutí určité doby od posledního vystavení UV záření se jako konečný bod testu vyhodnotí úroveň trvalé tmavosti pigmentu a pomocí souboru vzorců se vypočítá UVA-PF (o kterém bude pojednáno v části „Statistika a výpočty“ ).

Kritéria výběru účastníků

Přes kritéria uvedená v tabulce 1 (FDA 2007 a společná kritéria CEN) normy CEN dále uvádějí svá bezpečnostní opatření pro vstup do testu.

Mezi kritéria pro zařazení zdravého muže a ženy patří:

• Kůže typu II, III a IV13
• Nezúčastnit se v posledních dvou měsících žádných testů na slunci (žádné zbývající stopy na zádech).
• Nezasažení oblasti zad sluncem po dobu nejméně 2 měsíců před zahájením studie.
• Přítomnost jizev, nebo aktivních kožních lézí na testovaných oblastech zad.
• Testovaná oblast musí mít jednotnou barvu, bez znamének, skvrn nebo solárního lentiga, bez nadměrného ochlupení.

CEN také stanovil řadu vylučovacích testovacích kritérií;

• Subjekty nesplňující předchozí zařazovací kritéria.
• Těhotné nebo kojící ženy,
• V minulosti alergie, fotoalergie, fototoxicita nebo jiné abnormální reakce na sluneční záření nebo citlivost na kosmetické přípravky, toaletní potřeby, opalovací krémy, latex a/nebo lokální léčiva.
• Subjekty s dermatologickými problémy na testované oblasti.
• Subjekty, které v předchozím měsíci používaly samoopalovací přípravky na záda.

V důsledku toho se CEN jeví jako vhodnější pro osoby, které vybírají kritérium, díky větší konzistenci.

Počet účastníků

FDA 2007 a CEN používají 20 až 25 osob, resp. 10 až 20 osob. Stejně jako u jiných klinických studií platí, že čím vyšší počet účastníků, tím vyšší přesnost testu. Na druhou stranu velká velikost vzorku vede k některým problémům, jako je zpracování protokolu, zajištění dostatečného množství vzorků a odpadnutí dobrovolníků.

Referenční přípravky na opalování

Doporučuje se použít standardní vzorek pro ověření výsledků každého testovaného vzorku.

Test je platný, pokud je průměrný UVA-PF získaný pro referenční přípravek na opalování v uvedeném rozmezí. Podle tabulky 1 jsou oba referenční opalovací krémy dobrou volbou, protože jejich výsledky UVA-PF jsou si blízké a jejich účinné látky jsou schválené.

Velikost zkušebních míst a dílčích míst

Při výběru velikosti míst a dílčích míst je důležitá možnost použití simulátoru slunečního záření s více zdroji. To znamená, že volba menších velikostí lokalit a dílčích lokalit může vést k tomu, že UV záření bude vystaveno více dílčích lokalit současně. Proto jsou v této oblasti vhodnější standardní prvky CEN (pro velikost stanoviště 30 cm2 a pro dílčí stanoviště kruhy o průměru 8 mm).

Pro vzdálenosti mezi dvěma dílčími stanovišti navrhuje FDA 2007 interval 1 cm. CEN neuvádí žádný interval mezi dílčími místy, takže funkce FDA 2007 je pro vzdálenosti dílčích míst značná.

Výše dávky při nakládání

Výše dávky při nakládání testovaného a referenčního přípravku je stanovena téměř ve stejné výši. CEN navrhuje rozsah 2 mg/cm2±2,5 % a FDA 2007 navrhuje 2 mg/cm2, které by měly být rovnoměrně naloženy a rozprostřeny pomocí prstové postýlky. Produkt by měl být umístěn v malých kapkách po celé zkušební ploše a roztírán speciálními pohyby.

Doba roztírání by měla trvat 20 až 50 s. Plochy pro nakládání produktu by měly být vybrány náhodně.

Čekací doba mezi nanesením opalovacího krému a vystavením UV záření

Čekací doba navrhovaná mezi naložením výrobku a vystavením UV záření je podle FDA 2007 nejméně 15 min a podle CEN 15 až 30 min.

Zařízení pro ozařování a pravidelná kontrola jeho lampy

Tabulka 1 uvádí seznam specifikací zařízení pro ozařování pro každou z obou norem. Pokud jde o periodickou kontrolu zařízení, FDA 2007 a norma CEN navrhují, aby se kontrola prováděla každých 6, resp. 12 měsíců.

Podle FDA 2011 jsou kalibrační údaje solárních simulátorů a jejich UV lamp stabilní po dobu delší než 1 rok; periodické posouzení zařízení je tedy lepší zvážit jednou ročně.

Trend expozice

Jak je uvedeno u trendu expozice v tabulce 1, koncepce obou metod je stejná.

Čas a stav posouzení MPD

MPD je nejmenší množství UVA záření, které vytváří viditelné hmatatelné pigmentace s viditelnými hranicemi. Když je tmavost pigmentu fixována, MPD se hodnotí vizuálně. Pro hodnocení MPD CEN a FDA 2007 doporučují 2 až 4, resp. 3 až 24 h po poslední expozici místa. Oční hodnocení by měl provádět zkušený pozorovatel naslepo za přiměřených a rovnoměrných světelných podmínek. Úřad FDA uvádí, že se zdá, že ztmavnutí pigmentu je nejstabilnější přibližně 3 h a více po ozáření, a proto navrhuje, aby k tomuto pozorování došlo 3 až 24 h po ozáření. Toto časové rozmezí poskytuje větší flexibilitu zkušební metody, aniž by to bylo na úkor přesnosti. Proto se kritéria FDA z roku 2007 jeví jako lepší.

Vyhodnocení zkoušky stanovení UVA-PF in vitro

Všechny metody in vitro jsou založeny na vyhodnocení průchodu UV záření tenkou vrstvou opalovacího krému rozprostřeného na drsné desce, takže se vypočítá úroveň UV záření před a po vystavení kontrolované dávce ze zdroje záření. Ve fázi výpočtu úrovně ochrany před UVA však každá norma stanovuje jiné měřítko (tabulka 2).

Tabulka 2 In vitro UVA-.PF Srovnání protokolů stanovení

Norma FDA 2007 používá modifikovanou frakci Diffey, kde se plocha pod absorpční křivkou UVA1 (340 nm až 400 nm) dělí na celkovou absorpční oblast UVA a UVB (290 nm až 400 nm).14,15 Nicméně FDA 2011 zrušila modifikovanou Diffeyovu frakci z následujících důvodů:

1. Tato frakce poskytuje značnou pozornost oblasti UVA1, přičemž tato oblast nehraje hlavní roli při vzniku škodlivých účinků na kůži.
2. Pokud jedna nebo více složek výrobku produkuje, vysokou absorpci v oblasti UVA2 s krátkou vlnovou délkou a nízkou nebo žádnou adsorpci v oblasti UVA1, vzniká velký poměr, zatímco tento výrobek neprodukuje široký rozsah absorpce.
3. Tento navrhovaný poměr nevykazuje spolehlivý stupeň ochrany proti UVA a neuplatňuje se nikde jinde na světě.
4. Jedním ze způsobů, jak tento podíl zvýšit, je snížit množství vysoce absorpčních sloučenin v oblastech UVA2 a UVB, což však sníží úroveň ochrany v těchto oblastech spektra (jinými slovy, pro zvýšení podílu Diffey by se měl snížit SPF).

Norma ISO 24443 vypočítává ochranný faktor UVA v souladu s výsledky testu PPD. Obě normy CEN a FDA 2011 považují za vhodnou metodu kritické vlnové délky.

A (λ) je průměrná absorpce při každé vlnové délce a d (λ) je interval vlnových délek mezi jednotlivými výpočty.

Kritická vlnová délka je vlnová délka, při které oblast pod absorpční křivkou tvoří 90 % celkové plochy pod UV absorpční křivkou.

Úřad FDA dospěl k závěru, že doprovodná zkouška kritické vlnové délky (pro měření rozsahu ochrany proti UVB a UVA záření) a zkouška SPF (pro měření velikosti ochrany proti UVB a UVA záření) poskytují úplné měření širokospektrální schopnosti. Aby mohl být výrobek označen prohlášením o širokém spektru, měl by vytvářet kritickou vlnovou délku rovnou nebo větší než 370 nm.

Testovací destičky

Destičky jako místo zatížení hrají při testu klíčovou roli. Mezi křemennými destičkami, včetně PMMA (polymethylmetakrylát), hydratovaného kolagenu, epidermální kůže a transporové pásky, jsou pro svou novost vybrány destičky z PMMA. Následující důvody jsou určujícími faktory upřednostnění před ostatními typy destiček:

1. Je levnější než křemen.
2. Je připravena k použití a není třeba ji čistit ani znovu brousit.
3. Používá se více než deset let.

Co se týče velikosti desek, pokud desky o rozměrech 16 cm2 dávají přijatelné výsledky, není nutné používat desky o větších rozměrech (10,2 cm). Pokud jde o stupeň drsnosti těchto desek, norma FDA 2011 navrhuje stránky s drsností 2 až 7 µg a norma ISO 24443 nabízí drsnost 6 mikronů. Volba konstantní drsnosti 6 µm, která je shodná pro všechny tyto zkoušky, se zdá být rozumná.

Referenční složení opalovacího krému

Podle tabulky 2 má referenční opalovací krém pouze norma ISO 24443. Referenční opalovací krém S2 přináší UVA-PF 12,7.

Zdroj záření

Před měřením průchodu záření deskami pokrytými výrobkem se u těchto výrobků provádí ozařovací fáze pro zvážení optické stability. FDA 2011 se domnívá, že záření slunečního simulátoru (zařízení navržené FDA 2007) je filtrováno tak, že jeho energie na vlnových délkách pod 300 nm je menší než citlivost spektrofotometru, i když na desce není vložen žádný opalovací krém (tj. průchodnost je 100 %).

Proto FDA 2011 navrhuje zdroj záření vytvářející spojité spektrální rozložení UV záření od 290 do 400 nanometrů. Norma CEN navrhuje solární simulátor vybavený filtry.

Intervaly mezi měřeními

Pro měření průchodu vyzářeného UV záření při každé vlnové délce musí být intervaly mezi měřeními přerušované. Tyto intervaly jsou nastaveny v intervalech 1 nm a 5 nm podle tabulky 2. Bylo to uvedeno v dokumentu FDA 2011: V předložených dokumentech se uvádí, že stanovení menšího intervalu by vedlo k přesnějším výsledkům, a poznamenává se, že současné spektrometry jsou schopny provádět měření v intervalu 1 nm.

Dynamický rozsah spektrometru

Dynamický rozsah je jedním z ukazatelů pro kalibraci UV spektrofotometru. Dynamický rozsah spektrometru musí být dostatečný pro přesné měření průchodu vysoce absorpčních opalovacích krémů při všech vlnových délkách UV záření (290 nm až 400 nm).

Množství načítání produktu

Množství a postup načítání produktu na hrubou část desky je uveden v každé normě. Pro zajištění přesnosti množství naložení produktu můžeme použít metodu měření hmotnosti pipety před a po naložení nebo pomocí faktoru hustoty. Produkt se nakládá v kapkách o stejném objemu. V normách FDA 2007, CEN a ISO 24443 se používá hodnota 2 a 2 mg/cm2 , resp. 1,3 mg/cm2. FDA se domnívá, že průchod UV záření z tlusté vrstvy 2 mg/cm2 je menší a vede k nekonzistentním reakcím. Proto FDA stanovila množství zátěže na 0,75 mg/cm2, aby se zajistilo, že hladina procházejícího UV záření bude v dynamickém rozsahu UV detektorů.

Způsob distribuce produktu

Hladké rozprostření opalovacího přípravku na desce výrazně ovlivňuje přesnost testu. Jak ukazuje tabulka 2, proces roztírání může být jednofázový nebo dvoufázový s použitím nebo nepoužitím prstové postýlky. FDA 2011 považuje dvoufázové roztírání za účinnější způsob dosažení pevné a silné vrstvy. To přispívá k lepší distribuci pro širokou škálu lékových forem než technika měkkého roztírání po 10 s a je také podobné skutečnému používání spotřebiteli. Proto se stanovisko FDA 2011 a ISO 24443 ve způsobu roztírání přípravku jeví jako nejlepší možnosti.

Předradiační dávkování

Tato operace se provádí za účelem kontroly snížení optické stability. Opalovací krém se vloží na desku a poté se vystaví zdroji záření. Podle FDA 2011, protože v jednom čase a na jednom místě na zemském povrchu je sluneční záření stejné pro výrobky s vysokým nebo nízkým SPF a UVA-PF, pak dávka před ozářením ve formě frakce SPF nebo UVA-PF není logická. Úřad FDA 2011 proto navrhuje, aby dávka před ozářením byla konstantní hodnotou. Úřad FDA obdržel informace, ze kterých vyplývá, že výrobky obsahující avobenzon byly zcela zničeny při vystavení dávce odpovídající 2-3 MED (Minimal Erythemal Dose).

To je nejhorší scénář optické degradace, protože avobenzon je v monografiích opalovacích krémů nejnestabilnějším opalovacím krémem vůči světlu. 1MED u typu kůže 2 odpovídá 250 J/m2. V nařízení FDA 2011 je tedy stanovena dávka před ozářením 4MED, která odpovídá 800 J/m2.

Měření průchodu zářením

Po vystavení výrobků dávce před ozářením se destičky pokryté výrobkem umístí do spektrofotometru pro měření průchodu. Podle stanoviska FDA z roku 2011 (pětinásobné měření ze 3 stran), kdy je dosaženo uspokojivého výsledku s menším počtem výpočtů, pak není potřeba více času a nákladů.

Statistika a výpočty

Podle CEN se kritická vlnová délka získá z následujícího vzorce:

kde λC je kritická vlnová délka a MPF je monochromatický ochranný faktor, což je převrácená hodnota propustnosti při dané vlnové délce.

Podle normy ISO 24443 se původně individuální ochranný faktor UVA (UVA-PFI) na každé bázi (nejméně 4 báze) vypočítá podle následujícího vzorce:

kde P(λ) je akční spektrum PPD.

I(λ) je spektrální ozáření přijaté ze zdroje UVA.

Ae(λ) je střední monochromatická absorbance vrstvy zkoušeného produktu po expozici UV záření.

d(λ) je krok vlnové délky (1 nm).

C je koeficient úpravy. Počáteční hodnoty křivky absorbance se násobí skalární hodnotou „C“, dokud se hodnoty SPF vypočtené in vitro nerovnají SPF naměřenému in vivo. Toho se dosáhne v iteračním procesu výpočtu. Počáteční hodnoty absorbance vynásobené touto hodnotou „C“ se stanou upravenou křivkou absorbance opalovacího krému, která se použije pro stanovení počáteční hodnoty UVA-PF0 a expoziční dávky. Pro správnou interpretaci se hodnota „C“ obvykle pohybuje mezi 0,8 a 1,6. Pokud je mimo toto rozmezí, měly by se připravit nové vzorky pro ověření platnosti původních pozorování.

Takto se podle níže uvedeného vzorce vypočítá průměrný výpočet UVA-PF:

Je-li splněna tato podmínka Konfidenční interval (CI) n, je zkouška platná; v opačném případě by se měl počet základen zvýšit, pokud je podmínka splněna.

Pokud uvedená podmínka není splněna po použití 10 bází, je test prohlášen za neplatný.

Podle norem FDA 2011 a FDA 2007 se úroveň propustnosti UV záření vypočítá z následujícího vzorce:

Měření spektrálního ozáření prošlého pro každou vlnovou délku přes kontrolní PMMA destičky pokryté 15 µl glycerinu.

Měření spektrálního ozáření prošlého pro každou vlnovou délku λ přes PMMA destičku pokrytou opalovacím přípravkem. Průměrná absorpce v každé vlnové délce ( se vypočítá ze záporného logaritmu průměrného procházejícího UV záření takto:

Podle FDA 2011 se kritická vlnová délka vypočítá z tohoto vzorce;

Podle FDA 2007 se poměr frakce Diffey vypočítá takto:

Plocha UVA I na jednotku λ se udává jako:

Plocha UV na jednotku λ se udává jako:

Závěr

Vzhledem k úloze UVA při vzniku poškození kůže se používání opalovacích přípravků, které chrání kůži před UVA a UVB, jeví jako nezbytné. Pro hodnocení UVA-PF se upřednostňuje metoda in vivo vzhledem k její přesnosti a opakovatelnosti, jakož i simulaci skutečných podmínek používání u člověka. Mezi normami FDA 2007 a CEN, které zavádějí metodu PPD in vivo, mají obě výhody a nevýhody, takže použití lepšího přístupu v každém případě může přinést lepší výsledky.