Buněčná kultivace, amplifikace a purifikace viru pro experimenty SHAPE-MaP a SPLASH

Buňky Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) a Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) byly pěstovány v minimálním esenciálním médiu (Merck) doplněném 2 mM l-glutaminem a 10% FCS. Zásoby viru WSN (H1N1) byly vytvořeny infikováním buněk MDBK virem chřipky s multiplicitou infekce (MOI) 0,01. Virové zásoby virů Udorn (H3N2) a PR8 (H1N1) (PR8) byly vytvořeny infikováním buněk MDCK při MOI 0,001 v přítomnosti 0,8 μg ml-1 trypsinu ošetřeného n-Tosyl-l-fenylalanin-chlormetylketonem (TPCK) (Merck). Viry byly odebrány 2 dny po infekci. Viry byly přečištěny ultracentrifugací: nejprve bylo infikované médium buněčné kultury vyčištěno centrifugací při 4 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při 4 °C a následně centrifugací při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 °C. Virus byl poté přečištěn centrifugací přes 30% sacharózový polštář při 25 000 otáčkách za minutu po dobu 90 min při 4 °C v rotoru SW 32 (Beckman Coulter). Purifikovaná virová peleta byla resuspendována v resuspenzním pufru (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Poznamenáváme, že ultracentrifugací se nenarušují terciární struktury virionu ani RNA30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP byla provedena podle publikovaných prokotolů17; 1-methyl-7-nitroisatoanhydrid (1M7) byl syntetizován z 4-nitroisatoanhydridu, jak bylo popsáno dříve33. Pro experimenty s in vitro transkribovanou RNA byl každý segment virové RNA syntetizován z lineární DNA šablony pomocí HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). Velikost a čistota produktů byla zkontrolována na 3,5% polyakrylamidovém gelovém elektroforézním (PAGE) gelu. Vzorky holé virové RNA byly připraveny přečištěním částic WSN na sacharosovém polštáři, jak bylo popsáno dříve. Purifikované viry byly ošetřeny 250 μg ml-1 proteinázy K (Roche) v proteinázovém pufru K (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) po dobu 40 min při 37 °C. Před modifikací byly vzorky in vitro transkribované RNA a nahé virové RNA skládány při 37 °C po dobu 30 min ve skládacím pufru (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Ke složené RNA byl přidán 1M7 (rozpuštěný v bezvodém dimethylsulfoxidu (DMSO; Merck)) na konečnou koncentraci 10 mM a vzorky byly inkubovány 75 s při 37 °C. Modifikace in virio byly provedeny přidáním 1M7 přímo k purifikovanému viru. Schopnost činidel SHAPE-MaP pronikat virovými částicemi byla nejprve testována, jak bylo popsáno dříve34 , provedením prodloužení primerů značených 32P na RNA extrahované z viru upraveného činidlem SHAPE-MaP za použití primeru cíleného na NA segment (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′). Souběžně se vzorky ošetřenými 1M7 byly kontrolní vzorky ošetřeny DMSO. n-methylisatoic anhydride (NMIA; Thermo Fisher Scientific) SHAPE-MaP reagent byl také testován ve viru. Pokusy s NMIA byly provedeny stejně, jak bylo popsáno pro 1M7, s tím rozdílem, že purifikované viriony byly ošetřeny NMIA po dobu 45 min.

Příprava sekvenační knihovny byla provedena, jak bylo popsáno dříve17 , podle pracovního postupu randomizace. Stručně řečeno, po ošetření 1M7 nebo kontrole byla RNA přečištěna pomocí soupravy RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research). RNA byla reverzně transkribována pomocí Random Primer Mix (New England Biolabs) se SuperScriptem II (Invitrogen) v MaP pufru (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM dithiothreitol a 0,5 mM deoxynukleosidtrifosfát). K přípravě knihoven DNA byla použita sada Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina). Konečné produkty amplifikace PCR byly selektovány podle velikosti pomocí Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) a jejich kvalita byla posouzena pomocí sady Agilent DNA 1000 (Agilent Technologies) na systému Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Pro WSN, nahou virovou RNA a in vitro transkribovanou RNA byly knihovny sekvenovány (2 × 150 párů bází (bp)) na systému HiSeq 4000 (Illumina); pro viry PR8 a Udorn byly knihovny sekvenovány (1 × 150 bp) na systému NextSeq 500 (Illumina).

SPLASH

SPLASH vzorky byly připraveny podle dříve publikovaných postupů24,35 s určitými úpravami, a to vždy po dvou replikách pro viry WSN, PR8 a Udorn a po jedné replice pro každý z reassortantních virů H3N2. Purifikovaný virus byl inkubován s 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) a 0,01% digitoninem (Merck) po dobu 5 min při 37 °C. Virus byl rozprostřen na misku se 6 jamkami, přikryt skleněnou destičkou, umístěn na led a ozařován po dobu 45 min pomocí ruční UV lampy UVP Ultra Violet Product (Thermo Fisher Scientific). Zesíťovaný virus byl ošetřen proteinázou K a virová RNA byla extrahována pomocí TRIzolu (Invitrogen). Alikvotní část extrahované virové RNA byla použita k detekci inkorporace biotinu pomocí sady Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Fisher Scientific) na nylonové membráně Hybond-N (GE Healthcare Life Sciences). Zbytek extrahované virové RNA byl fragmentován pomocí NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) a velikostně selektován na fragmenty kratší než 200 nt pomocí RNA Clean & Concentrator-5 Kit. Vzorky byly obohaceny o biotinylovanou virovou RNA pomocí kuliček Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific); proximitní ligace na kuličkách a psoralenová křížová vazba byly provedeny podle dříve publikovaných postupů24,35. Sekvenační knihovny byly připraveny pomocí komerční sady SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories). Konečná selekce velikosti byla provedena tak, že PCR-amplifikované sekvenační knihovny byly naneseny na 6% PAGE gel (Thermo Fisher Scientific) v Tris/kyselina boritá/EDTA (TBE), přičemž byla selektována DNA o velikosti 200-300 bp. Knihovny byly sekvenovány 1 × 150 bp na systému NextSeq 500.

Zpracování sekvenačních čtení SHAPE-MaP

Sekvenační čtení byla ořezána za účelem odstranění adaptérů pomocí programu Skewer v0.2.2 (ref. 36). Profily reaktivity SHAPE-MaP byly generovány pomocí publikované pipeline ShapeMapper237 , která zarovnává čtení k referenčnímu genomu a vypočítává míru mutací v každé nukleotidové pozici. Míry mutací se poté převedou na hodnoty reaktivity SHAPE-MaP definované jako:

kde mutr1M7 je míra mutace nukleotidů ve vzorku ošetřeném 1M7 a mutrDMSO je míra mutace ve vzorku ošetřeném DMSO. Všechny reaktivity SHAPE-MaP byly normalizovány na přibližnou stupnici 0-2 vydělením hodnot reaktivity SHAPE-MaP průměrnou reaktivitou 10 % nejvíce reaktivních nukleotidů po vyloučení odlehlých hodnot (definovaných jako nukleotidy s hodnotami reaktivity, které jsou >1,5 mezikvartilového rozpětí). Vysoké reaktivity SHAPE-MaP označují flexibilnější (tj. jednovláknové) oblasti RNA a nízké reaktivity SHAPE-MaP označují strukturně omezenější (tj. bázově spárovanější) oblasti RNA.

Zpracování sekvenačních čtení SPLASH

Sekvenační čtení byla ořezána za účelem odstranění adaptérů pomocí programu Skewer v0.2.2 (ref. 36). K zarovnání čtení k příslušnému referenčnímu genomu viru byl použit STAR v.2.5.3 (ref. 38) (Doplňková tabulka 2). Při dalším zpracování byla použita pouze chimérická čtení, u nichž bylo zarovnáno alespoň 20 nt s referenčními segmenty (parametr STAR: -chimSegmentMin 20). Chimérická čtení byla deduplikována pomocí řetězců CIGAR a pozic pro zarovnání. Řetězce CIGAR v každém zarovnání čtení byly zpracovány za účelem zjištění počátečních a koncových souřadnic čtení. Souřadnice chimérických čtení byly použity k vytvoření matice sekvenčních interakcí v softwaru R. Diskrétní lokusy v matici byly vybrány a individuálně vybaveny Gaussovou křivkou založenou na intenzitě překrývání čtení pro definování interakčního okna; interakční okna komplexně se překrývajících lokusů byla rozdělena do jednotlivých oken. Šířka interakčního okna byla použita k určení počátečních a koncových souřadnic každé interakce; počet čtení, která se nacházela uvnitř (nebo částečně uvnitř) této oblasti, byl použit jako míra frekvence interakcí. Pro generování obrázků bylo 20 nejčastějších interakcí v každém viru vizualizováno pomocí balíčku circlize v.0.4.5 (ref. 39) v R v.3.5.1. Úplný soubor interakčních lokusů je uveden v doplňkové tabulce 2. Pro ověření interakčních lokusů pomocí qPCR byly připraveny a obohaceny vzorky s psoralenem, jak bylo popsáno dříve, ale se zkrácenou dobou fragmentace (3 versus 4 min), aby vznikly delší fragmenty RNA. RNA byla polyadenylována pomocí poly(A) polymerázy (Takara Bio) a komplementární DNA byla generována pomocí primeru smRNA dT (Takara Bio) a reverzní transkriptázy PrimeScript (Takara Bio) podle pokynů výrobce. QPCR s 50 cykly byla provedena podle pokynů výrobce na přístroji StepOnePlus (Applied Biosystems) za použití Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) a párů primerů pro testování mezisegmentových interakcí. Sekvence primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 3. Po 50 cyklech amplifikace qPCR byly produkty rozlišeny pomocí 8% PAGE (29:1 akrylamid/bis-akrylamid, 1× TBE pufr) a vizualizovány pomocí transiluminace modrým světlem.

Předpovědi struktury RNA

Algoritmus IntaRNA v.2.3.1 (ref. 40) byl použit k předpovědi schopnosti interakcí RNA-RNA v oblastech identifikovaných během analýzy SPLASH s použitím možností Exact mode (-mode E) a no seed constraint (-noSeed). Reaktivity SHAPE-MaP byly zahrnuty do modelování interakcí RNA-RNA (-tShape a -qShape). Permutované soubory dat byly vytvořeny náhodným zamícháním specifických interakčních partnerů identifikovaných pomocí SPLASH a vyhodnocením interakčních energií ΔG pomocí IntaRNA. Významnost rozdílu mezi pravděpodobnostními rozděleními energií ΔG spojených s mezimolekulárními interakcemi RNA identifikovanými pomocí SPLASH a permutovanými soubory dat byla vypočtena pomocí Wilcoxonova rank-sum testu v softwaru R. Předpovědi struktury IntaRNA byly poté použity k ořezání interakčních oblastí na nukleotidy zapojené do párování bází. Tam, kde nebyla k dispozici data SHAPE-MaP (reassortanti PR8 s viry H3N2), bylo v IntaRNA vypnuto předběžné skládání každého vlákna RNA („přístupnost“) (-qAcc = N -tAcc = N). Pro ověření oproti známým strukturám byla data o sekundární struktuře RNA získána z databáze RNA3Dhub41 na základě struktur kryogenní elektronové mikroskopie ribozomu 80S42 (PDB: 6EK0) a z trojitého malého jaderného ribonukleoproteinového spliceozomálního komplexu U4/U6.U543 (EMDB: EMD-2966). Referenční sekvence RNA byly opraveny tak, aby odpovídaly hovězím (MDBK) sekvencím pro ribozomální RNA a malé jaderné RNA U4/U6, jak bylo popsáno dříve44. Pro předpovědi intramolekulární struktury RNA byl použit balík ViennaRNA v.2.0 (ref. 45). K předpovědi sekundárních struktur RNA a rozdělovacích funkcí pro každý segment byl použit příkaz RNAfold. Reaktivity SHAPE-MaP byly zahrnuty jako pseudoenergetické omezení. K určení míry korelace SHAPE-MaP mezi RNA přepisovanou T7 a RNA asociovanou s vRNP byla použita korelační analýza s klouzavým mediánovým oknem o velikosti 50 nt mezi profily reaktivity SHAPE-MaP ex virio a in virio. Zjistili jsme, že neexistuje žádná korelace >150 nt; proto jsme pro předpovědi struktury a rozdělovací funkce stanovili omezení maximální párovací vzdálenosti na 150 nt. Pro předpovědi intramolekulární struktury jsme nastavili nukleotidy v promotorové oblasti jako jednovláknové.

Buněčné kultury pro reverzní inženýrství chřipkových virů

Buňky MDCK a lidské embryonální ledviny (HEK 293T) byly získány z existující sbírky na katedře mikrobiologie a imunologie univerzity v Melbourne. Buňky MDCK byly pěstovány v médiu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich) a buňky HEK 293T byly pěstovány v médiu DMEM (Thermo Fisher Scientific). Obě média byla doplněna 10 % tepelně aktivovaného FCS, 2 mM l-glutaminem, 2 mM pyruvátem sodným, 24 μg ml-1 gentamicinu, 50 μg ml-1 streptomycinu a 50 IU ml-1 penicilinu. Kokultury buněk MDCK a buněk HEK 293T pro transfekci byly vytvořeny v Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) s 50 μg ml-1 streptomycinu a 50 IU ml-1 penicilinu.

Konstrukce reverzně upravených chřipkových virů

Individuální genové segmenty z virů PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) a Wyo03 (H3N2) byly reverzně přepsány a klonovány do plazmidů pHW200046. Viry odvozené reverzní genetikou obsahovaly buď gen PR8, Udorn, Mem71, PC73 nebo Wyo03 PB1 s divokým typem nebo modifikovaným genem NA na genetickém pozadí obsahujícím šest segmentů z viru PR8 (PB2, PA, HA, NP, M a NS). Modifikovaný gen NA (Wyo03UdSub) byl odvozen od Wyo03 a nesl 4 substituce vůči sekvenci Udorn-NA: nukleotidy G943A; C938U; U933C; a G923A. Tři z těchto čtyř nukleotidových změn byly tiché, čtvrtá (A534G) vedla ke konzervativní změně lysinu na arginin (K172R). Komplementární fragmenty obsahující tyto změny byly vytvořeny pomocí PCR a spojeny dalším kolem PCR s použitím segmentově specifických primerů obsahujících restrikční místa BsmBI47; produkt byl klonován do expresního vektoru pHW2000 pro záchranu viru. Sekvence primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 3. Zachráněné viry byly amplifikovány v 10 d embryonovaných slepičích vejcích. Infekční alantoická tekutina byla titrována na obsah viru pomocí tvorby plaků v buňkách MDCK48 a skladována při -80 °C.

Stanovení kinetiky replikace virů reverzního inženýrství

Replikační charakteristiky virů reverzního inženýrství byly stanoveny infikováním buněk MDCK při MOI 0,01. V případě, že se viry reverzního inženýrství vyskytovaly v buňkách MDCK, byly jejich replikační charakteristiky stanoveny na základě MOI. Po 1 hodině absorpce (při t = 0 h) bylo inokulum odstraněno a buňky byly promyty a inkubovány při 37 °C, 5 % CO2 v RPMI 1640 doplněném 2 mM l-glutaminem, 2 mM pyruvátem sodným, 24 μg ml-1 gentamicinu, 50 μg ml-1 streptomycinu, 50 IU ml-1 penicilinu a 1 μg ml-1 trypsinu upraveného TPCK (Worthington Biochemical Corporation). Supernatanty buněčných kultur byly odebrány v různých časových bodech po infekci a uloženy při -80 °C pro analýzu. Titry virů byly stanoveny pomocí tvorby plaků na konfluentních monovrstvách buněk MDCK.

Konkurenční reverzní inženýrství chřipkových virů s devíti plazmidy

Konkurenční reverzní inženýrství chřipkových virů bylo provedeno pomocí modifikované verze systému reverzní genetiky s osmi plazmidy26 , jak bylo popsáno dříve25. Stručně řečeno, plazmidy kódující segmenty virové RNA PB2, PB1, PA, hemaglutininu (HA), nukleoproteinu (NP), matrixového proteinu (M) a nestrukturálního proteinu (NS) PR8 byly kotransfekovány s plazmidy kódujícími virovou RNA neuraminidázy (NA) a konkurenční virovou RNA PB1 Udorn, Mem71, PC73 nebo divokého typu či modifikovaného Wyo03. Každý plazmid (1 µg) byl smíchán s transfekčním činidlem FuGENE 6 (Promega) v Opti-MEM a přidán do kokultury buněk HEK 293T a MDCK. Šest hodin po transfekci bylo médium nahrazeno Opti-MEM doplněným 50 μg ml-1 streptomycinu a 50 IU ml-1 penicilinu. O 24 hodin později byl přidán trypsin ošetřený TPCK (1 μg ml-1) a supernatant byl po dalších 42 hodinách odebrán a uložen při -80 °C. Pro stanovení frekvence inkorporace konkurenčních genů PB1 byly potomky virů v transfekčním supernatantu podrobeny plakovému testu v buňkách MDCK. Náhodně vybrané plaky (přibližně 36 na experiment) byly vybrány vzorkováním přes agarózu a resuspendovány v 0,05% Triton-X100. Zdroj konkurenčních genových segmentů byl identifikován pomocí genově specifické kvantitativní RT-PCR s použitím jednostupňové sady SensiFast probe no-ROX RT-PCR Kit (Bioline). Každá reakce o objemu 20 μl byla provedena za použití 5 μl suspenze viru odebraného z plaku, 10 μl směsi 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step, 0,2 μl reverzní transkriptázy, 0,4 μl inhibitoru RNázy Ribosafe, 0,8 μl každého 10 μM dopředného a zpětného primeru specifického pro gen a 0,08 μl každé 25 μM sondy specifické pro gen. Sekvence primerů a sond jsou uvedeny v doplňkové tabulce 3. Reakce RT-PCR byla inkubována 10 minut při 45 °C a poté se pokračovalo v amplifikaci qPCR podle pokynů výrobce. Uváděné hodnoty jsou kombinované údaje ze 3-8 nezávislých transfekčních experimentů pro každou soutěž.

Souhrn zpráv

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici v Souhrnu zpráv o výzkumu v časopise Nature, který je propojen s tímto článkem.

.