Abstrakt
Předkládaná práce přináší podrobný popis ultrastruktury sekrečních buněk pankreatických ostrůvků jihoamerického sumečka Rhamdia quelen. Jsou předloženy důkazy na podporu tvrzení, že α-granule se skládají z centrální a vnější části s různou elektronovou hustotou a rozpustností, že δ-buňky jsou s největší pravděpodobností morfologicky změněné, ale životaschopné α-buňky a že β-granule mají pravděpodobně opakující se substrukturu, a mohou tedy představovat intracelulární krystalickou zásobní formu inzulínu.
1. Úvod
Langerhansovy ostrůvky objevil Langerhans u králíka v roce 1869. Zhruba o 20 let dříve je však u teleostů popsali Stannius a Blockmann, a proto se také, i když méně často, označují jako Stanniova nebo Blockmannova tělíska. Langerhansovy ostrůvky jsou endodermálního původu a u většiny teleostů se vyskytují jako malá tělíska rozptýlená v exokrinní části pankreatu.
Ryba nemá oddělenou slinivku. Exokrinní pankreatickou tkáň lze nalézt roztroušenou podél střevního traktu. Akinární struktura exokrinního pankreatu je velmi podobná struktuře savců a skládá se z buněk s velmi tmavou, bazofilní cytoplazmou . U aktivně se živících ryb obsahují velké množství světlých eozinofilních sekrečních granulí. Lze rozlišit endokrinní Langerhansův ostrůvek, jehož tkáň zahrnuje α-buňky (produkující peptid podobný glukagonu), β-buňky (produkující inzulin) a d-buňky (produkující somatostatin) . U savců a lidí byla většina dřívějších elektronmikroskopických popisů ostrůvků pankreatu dospělého člověka stručná a menší části publikací jsou věnovány především popisům nádorů β-buněk nebo přehledovým článkům pojednávajícím o srovnávací morfologii ostrůvků několika druhů .
Rybí pankreas se často neukáže jako pohotový zdroj tkáně pro elektronmikroskopické studium. Hlavní pankreas ryb je anatomicky i vývojově podobný pankreatu savců, zatímco u ostatních druhů ryb jsou patrné velké rozdíly. U dospělých zebřiček obsahuje hlavní pankreas několik hlavních ostrůvků obklopených exokrinní tkání. Podél střeva se kaudálně táhne ocásek jednotlivých ostrůvků uložených v exokrinní tkáni a tuku. Naproti tomu β-buňky tilapie (další teleostní ryby citlivé na glukózu) se nacházejí v Langerhansových ostrůvcích umístěných podél mezenteria, které nejsou obklopeny exokrinní tkání . Rhamdia quelen patří mezi teleosty a je důležitým druhem pro akvakulturu v subtropickém podnebí. R. quelen se vyskytují od jižního Mexika po střední Argentinu a chov tohoto druhu se rozšiřuje směrem k jižní Brazílii .
V této studii analyzujeme ultrastrukturu Langerhansových ostrůvků a podrobně popisujeme různé typy sekrečních buněk u jihoamerického sumečka R. quelen. quelen.
2. Materiál a metody
Čtyři chovaní R. quelem dvě samice a dva samci ( g; cm) z Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) v severovýchodní oblasti Argentiny a nasazeni do 200l nádrží, kde byli aklimatizováni dva týdny před nekropsií. Ryby byly chovány ve filtrované sladké vodě o teplotě 25 °C s denní výměnou vody 100 %. Fotoperioda byla nastavena na 12 hodin tmy a 12 hodin světla. Byly krmeny čtyřikrát denně komerční dietou (Ganave). Ryby byly eutanazovány benzokainem (500 ppm), nekropsovány a vzorky tuku, který se táhne kaudálně podél střeva, byly fixovány v 10% pufrovaném formalínu, zality do parafínu a obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E).
Malé fragmenty tkáně byly rozřezány na 1mm bloky a ihned fixovány ve fosfátovém pufru s glutaraldehydem (pH 6.).9 při 4 °C), promyty v Millonigově roztoku a postfixovány v 1% tetroxidu osmia; tkáňové bloky byly poté dehydratovány v odstupňované sérii ethanol-aceton, ponořeny do propylenoxidu a vloženy do Durcupanu ACNI (Fluka Chemie A.G., Švýcarsko). Tenké řezy byly vyříznuty ultramikrotomem LKB a před vyšetřením v elektronovém mikroskopu Jeol JEM-8T (Jeol, Tokio, Japonsko) byly dvakrát obarveny uranyl-acetátem a citrátem olovnatým.
3. Výsledky
3.1. Průzkum a vyhodnocení vzorků Světelná mikroskopie
R. quelen mají pankreas rozptýlený v tukové tkáni obklopující společný žlučovod; ten leží v přibližně trojúhelníkové oblasti ohraničené nahoře žaludkem, vpředu játry a dole slezinou a žlučníkem. Každý Langerhansův ostrůvek se skládá z relativně čisté ostrůvkové tkáně obklopené exokrinním pankreatem (obrázek 1). Nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi muži a ženami.
3.2. . Elektronová mikroskopie
Buňky β, které obvykle zaujímají vnitřní část ostrůvků, byly běžně, ale ne vždy, odděleny od exokrinního pankreatu periferně umístěnými buňkami α (obr. 2). Ultrastrukturální vzhled β-buněk byl u vzorků získaných ze čtyř ryb shodný. Výrazné β-granule byly obsaženy ve váčcích s hladkou membránou a měly různou velikost a tvar. Byly patrné obdélníkové, čtvercové, šestihranné a nepravidelně mnohoúhelníkové krystaly. Kulaté formy byly přítomny, ale méně často (obr. 2 až 5). Každá granule se skládala z jedné nebo několika krystalických nebo nestrukturních forem různé velikosti a tvaru. Nezdá se, že by volba fixačního činidla měla vliv na vnitřní strukturu β granulí. V mezích obalové membrány se oblast na okraji krystalů jevila prázdná nebo obsahovala jemnou vločkovitou sraženinu, a to bez ohledu na použité fixační činidlo. Při větším zvětšení byla u krystalů správně orientovaných vzhledem k rovině řezu někdy patrná opakující se substruktura (obrázky 6 a 7). Četné mitochondrie byly rozptýleny po celé buňce a jevily se jako zaoblené nebo baculaté vláknité struktury. Byly větší a početnější než v β-buňkách, ale obvykle menší než v acinárních buňkách pankreatu. Četné mitochondriální kristy byly většinou orientovány příčně a mitochondriální granula byla přítomna, ale nebyla výrazná. Cisterny granulárního endoplazmatického retikula byly obvykle krátké nebo vezikulární (obrázky 2 až 4). Granulární endoplazmatické retikulum a volné ribozomy nebyly u β-buněk tak výrazným znakem jako u acinárních nebo β-buněk. Ty β-buňky, které měly normálně málo sekrečních granulí, byly bohatěji vybaveny ribozomy a granulárním endoplazmatickým retikulem, které pak mělo častěji cisternální uspořádání (obrázek 5).
Golgiho komplex byl po fixaci aldehydem výraznější a složkové struktury byly více rozšířené (obr. 2). Po použití těchto fixativ byl uvnitř Golgiho vezikul občas viditelný hustý amorfní materiál, který může představovat nezralá granula nebo prekurzory β-sekrečních granulí. Jádra β-buněk byla obvykle kulovitá a měla relativně hladký obrys. Buněčná membrána sousedních buněk ostrůvků byla v těsném sousedství desmosomů, i když jimi nebyla často spojena. Na spojnici tří nebo více buněk byly hraniční membrány často zkroucené, s torzovitým propojením buněk (obrázky 2 a 9). Ve většině β-buněk byly nápadné multivesikulární cytoplazmatické inkluze připomínající ceroid (obrázky 2, 7, 9 a 8). Vzhled a četnost těchto inkluzí nebyly znatelně ovlivněny primárním použitím kyseliny osmové nebo aldehydu jako fixativa a nebyl zjištěn žádný zjevný vztah mezi přítomností těchto granulí a morfologickým důkazem fyziologické aktivity buněk. Ultrastruktura α-buněk byla ve všech čtyřech vzorcích tkání stejná. Velikost a tvar těchto buněk a jejich jader se výrazně nelišily od normálních β-buněk (obrázky 2 a 7). I když se občas vyskytla α-buňka s nepravidelně tvarovaným nebo vroubkovaným jádrem, nevyskytovala se dostatečně často na to, aby sloužila jako užitečné rozlišovací kritérium. Cytoplazmatická granula α-buněk se při primární fixaci osmiem zachovala jako hustá kulovitá tělíska různé velikosti a byla obsažena ve volně přiléhajících hladkých membránových váčcích (obrázky 7 a 9). Byly větší než β-granule, ale podstatně menší než zymogenní granule acinárních buněk (obrázek 2). Štíhlé, protáhlé mitochondrie byly středně početné a menší než mitochondrie β-buněk a měly krysty, které byly obvykle orientovány příčně. Granulární endoplazmatické retikulum mělo často cisternální uspořádání a bylo hojnější než v β-buňkách (obrázek 9). Golgiho komplex, pokud byl viditelný, byl středně velký. Husté amorfní materiály uvnitř Golgiho vezikul a cisteren, pravděpodobně předchůdci sekrečních granul, byly častější v buňkách α než v buňkách β (obr. 10). Ceroidní tělíska, ačkoli byla často viditelná, byla méně početná než v β-buňkách (obrázky 2 a 3). Váčky, v nichž se α-granule nacházejí, se tedy zdály být zcela zaplněné, a proto se dospělo k závěru, že granule se skládají ze zaobleného vnitřního hustého jádra a vnějšího méně elektronově hustého pláště, který po fixaci osmiem chyběl (obrázky 3 a 9), a proto jsou možná rozpustnější. Ve vnitřních ani okrajových částech α-granulí nebyla patrná žádná konzistentní substruktura. Nikdy nebyly pozorovány buňky, které by bylo možné interpretovat jako přechodné formy mezi α-buňkami a β-buňkami. Celkové rozměry α-granulí, včetně vnějších i vnitřních hustších částí, byly srovnatelné s „δ-granulemi“. Navíc jsou přítomny přechodné buňky, které obsahovaly granula obou typů, což naznačuje, že δ-buňky byly ve skutečnosti modifikované α-buňky (obrázek 10). Buňky δ byly vizualizovány, i když se téměř vždy nacházely mezi buňkami α, a byly identifikovány a ultrastrukturálně odlišeny od buněk α na základě nižší elektronové hustoty a větší celkové velikosti jejich sekrečních granulí. Navíc jsou přítomny intermediární buňky, které obsahovaly granula obou typů, což naznačuje, že δ-buňky byly ve skutečnosti modifikované α-buňky (obrázek 11).
Ačkoli existoval inverzní vztah mezi počtem sekrečních granulí a prominencí Golgiho komplexu a granulárního endoplazmatického retikula, nebyl pozorován žádný vzorec uvolňování α- nebo β- granulí. Tenká bazální membrána a různé množství pojivové tkáně obvykle oddělovaly pankreatické ostrůvky od sousedních acinárních buněk (obrázek 2). Příležitostně však mezi ostrůvky a acinárními buňkami nezasahovala žádná bazální membrána a ty pak byly odděleny pouze úzkým intersticiálním prostorem. Fenestrované endoteliální buňky kapilár byly od nich vždy odděleny alespoň kapilární bazální membránou (obrázek 9). Někdy byly přítomny i další podpůrné prvky, včetně kolagenu a složek elastické tkáně. Nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi samci a samicemi.
4. Diskuse
Rybí β-buňky jsou snadno odlišitelné od α-buněk podle morfologie sekrečních granulí. Častá přítomnost úhlových podjednotek a zjevná opakující se substruktura naznačují krystalickou povahu β-granulí. Pokusy o rozlišení a změření rozměrů krystalové mřížky zatím nebyly úspěšné. Při vizualizaci sekrečních granulí v blízkosti Golgiho komplexu nebyly obvykle pozorovány krystalické podjednotky. Je proto lákavé spekulovat, že nekrystalické granule nebo amorfní materiál uvnitř Golgiho komplexu představují jinou chemickou nebo fyzikální formu inzulinu nebo inzulinového proteinového komplexu než krystalické podjednotky granulí. Není známo, zda tyto různé morfologické formy v rámci β-granulí mají různou rozpustnost a možná i různé vzorce neboaty uvolňování v reakci na fyziologickou potřebu. Sekreční granule nebyly pozorovány v cisternách nebo vezikulách granulárního endoplazmatického retikula. Předpokládá se, že stejně jako u jiných buněk vylučujících bílkoviny funguje Golgiho komplex k soustředění nebo „zabalení“ produktu syntetizovaného v granulárním endoplazmatickém retikulu . Z toho by logicky vyplývalo, že váčky s hladkou membránou, v nichž jsou obsažena sekreční granula, pocházejí spíše z Golgiho membrán než z granulárního endoplazmatického retikula.
Buňky α s velkými, zaoblenými a hustými sekrečními granuly jsou dosti podobné buňkám α jiných druhů. Ačkoli granule α-buněk mají velmi rozdílné rozměry, zdá se, že většina buněk má sortiment různě velkých granulí, což vylučuje subklasifikaci tohoto typu buněk, jak bylo navrženo u jiných druhů . V současné době nebyly publikovány žádné fyziologické údaje, které by potvrzovaly existenci „δ-buněk“ v pankreatických ostrůvcích ryb. Různí protagonisté podpořili existenci δ-buněk údaji založenými na světelně mikroskopických vyšetřeních kapriciózního stříbra, kyseliny fosfotungové a hematoxylinu a jiných barvení granulí nebo na elektronově mikroskopických studiích špatně zachovalých tkání. Předložené mikrofotografie podporují názor, o němž uvažoval Bloom v roce 1931 a následně Gomori v roce 1941, že δ-buňky mohou představovat modifikované α-buňky.
Přechod od typické α-granule s vnitřní hustou a vnější méně hustou částí k δ-granuli přibližně stejné velikosti, s rovnoměrnou, ale sníženou hustotou, je často doprovázen postupnou ztrátou morfologické integrity nebo intenzity barvení mitochondrií, Golgiho komplexu a membránových složek granulárního endoplazmatického retikula. Neporušená a životaschopně vypadající jádra, stejně jako přetrvávající malý počet volných ribozomů a ceroidních tělísek, naznačují, že takzvané δ-buňky jsou životaschopné i v předpokládaném konečném stadiu tohoto přechodu, tj. tam, kde samotná sekreční granula již nejsou viditelná a všechny cytoplazmatické organely kromě ceroidních granul a ribozomů chybí. Vzhledem k tomu, že chybí fyziologické údaje, které by δ-buňkám přisuzovaly nějakou funkci, a vzhledem k absenci přesvědčivějších morfologických důkazů pro samostatný buněčný typ, doufáme, že zde prezentovaný pravděpodobný přechod od α-buněk k δ-buňkám bude přijat jako nejpravděpodobnější vysvětlení třetí Bloomovy granulární buňky u člověka. Význam těchto životaschopných, ale pozměněných α-buněk není znám. Ačkoli α- a β-buňky, jednotlivě nebo v malých shlucích, lze pozorovat uvnitř acinů a duktů, v žádném ze čtyř studovaných vzorků pankreatu nebyly pozorovány žádné přechodné formy mezi acinem a ostrůvkem nebo buňkami duktu a ostrůvku, jak navrhovali Nakamura a Yokote (4).
Konflikt zájmů
Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke konfliktu zájmů.
Poděkování
L. A. Romano obdržel stipendium na výzkum produktivity od Brazilské rady pro výzkum, CNPq (proces č. PQ 301002/2012-6).