Aristoteles underviste Alexander (356-323 f.v.t.), før fyrsten arvede Makedoniens trone i 336 f.v.t. og begyndte at udvide det imperium, som hans far havde vundet ved erobring. Senere kom haven på Lyceum i Athen til at indeholde planter, der blev bidraget af tilhængere af Alexanders hære. Theophrastus baserede mange af sine plantebeskrivelser på beretninger, som han fik fra rejsende, der havde besøgt fjerne egne af Alexanders imperium. Biblioteket i Alexandria, som Dioskorides sandsynligvis brugte, åbnede under Alexanders general Ptolemæus I Soter (ca. 367 f.v.t.e.-ca. 283 f.v.t.e.). Ptolemæus I var en nær personlig ven af Alexander og kan have været en medstuderende, der blev undervist af Aristoteles. Han blev hersker over Egypten i 323 f.v.t. efter Alexanders død. Det egentlige arbejde med at planlægge og overvåge biblioteket blev uddelegeret til Demetrius af Phaleron (ca. 350-ca. 280 f.v.t.), en af Theophrastos’ elever på Lyceum.

Alexander regerede Makedonien som regent fra 340 f.v.t., mens hans far, Filip II, ledede en stor makedonsk hær, der invaderede Thrakien, som var det land, der grænser op til Makedonien i øst. Senere kom Alexander i skænderi med Filip og forlod Makedonien, men i 336 f.v.t. blev Filip myrdet, og Alexander blev som 20-årig Alexander III af Makedonien, senere kaldet Alexander den Store. Da nyheden om Philips død spredte sig, så folk i de lande, der var erobret af makedonerne, en chance for at gribe deres frihed, og Alexander måtte handle. Han begyndte med at henrette alle sine modstandere inden for Makedonien og genoprettede derefter det makedonske styre i Grækenland, Thrakien og Illyrien.

I 334 f.v.t. førte Alexander en stor styrke ind i Lilleasien som den første fase af sin imperiale ekspansion, idet han efterlod en erfaren general Antipater (ca. 398-319 f.v.t.) til at opretholde ro og orden i hjemlandet. Makedonerne besejrede en stor persisk hær, sikrede sig kysten i Lilleasien, og i 333 f.v.t. bekæmpede og besejrede de en anden persisk hær, denne gang ledet af den persiske konge Darius III. Alexanders styrker kæmpede sig derefter sydpå gennem Syrien og Fønikien. I foråret 331 f.v.t. trængte makedonerne ind i Egypten. Efter et par måneder vendte de tilbage til Tyrus, hvor de modtog forstærkninger fra Europa og drog mod øst. De besejrede perserne endnu en gang ved Gaugemala øst for Tigrisfloden, besatte Babylon og indtog derefter Susa og Persernes hovedstad, Persepolis, og Alexander blev udråbt til konge af Asien. Makedonerne genoptog derefter deres jagt på Darius, som de fandt døende af sår påført af en af hans egne adelsmænd – som senere blev taget til fange af makedonerne og straffet af Alexander på hans ordre. De trængte østpå ind i Centralasien og nåede frem til Tian Shan-bjergene i det vestlige Kina, hvor man har fundet en statuette af en græsk soldat i et gravsted.

I 326 f.v.t. inviterede Alexander høvdinge fra det, der nu er det nordlige Pakistan, til at underkaste sig hans styre. Nogle indvilligede, men andre modsatte sig makedonerne og blev først overvundet efter intense kampe, hvor Alexander blev såret. De makedonske soldater, som længtes efter at se deres hjem og familier, modsatte sig Alexanders plan om at trænge længere ind i Indien og overtalte ham til at vende om. De nåede Babylon, hvor Alexander døde den 11. juni 323 f.v.t. i Nebukadrezar II’s palads. Historikerne er usikre på årsagen til hans død, men det er mest sandsynligt, at den skyldtes sygdom. Om en måned mere ville Alexander være blevet 33 år gammel. Som det fremgår af følgende kort, strakte hans imperium sig på sit højdepunkt fra Makedonien i vest til Indusdalen i øst og fra de sydlige kyster af Sortehavet og Det Kaspiske Hav til Egypten. Imperiet begyndte at gå i opløsning få år efter Alexanders død og brød sammen i mange uafhængige kongeriger.

Alexander havde været elev af Aristoteles, og selv om den unge mands uddannelse blev afbrudt, var han meget intelligent, og Aristoteles havde udøvet en stærk indflydelse på hans udvikling. Aristoteles opfordrede alle sine elever til at observere og undersøge naturen, og Alexander var meget interesseret i planter og dyr. Et stort følge af lærde fulgte ham, når han førte sine hære. De målte afstande, udarbejdede kort, studerede ukendte religioner og også flora og fauna. Når de stødte på ukendte plante- eller dyrearter, sendte Alexander eksemplarer tilbage til Europa, mange af dem til Lyceum i Athen, så Aristoteles selv kunne blive opmærksom på dem. Han indsamlede de oplysninger, han kunne om lokale urtebehandlinger, og han praktiserede medicin og behandlede personligt nogle af de skader og sygdomme, som hans soldater blev ramt af.

I 332 f.v.t. grundlagde Alexander byen Alexandria på stedet for Rhakotis, en egyptisk fiskerihavn. Han havde til hensigt, at byen skulle bygge bro mellem kulturerne i Grækenland og Egypten, men han blev der kun i nogle få måneder, efter at byggeriet var begyndt, og han vendte aldrig tilbage. Efter Alexanders død lykkedes det Ptolemæus I at få hans lig bragt til byen. Biblioteket i Alexandria blev bygget som en kopi af Lyceum, med en søjlegang og haver. Der var foredragssale, læsesale og en fælles spisesal, og biblioteket lå ved siden af og i tjeneste af Musaeum, som var et tempel, der blev brugt som en akademisk institution – og som er oprindelsen til ordet museum. Bibliotekets ledere fik til opgave at indsamle al information i verden. Repræsentanter for biblioteket deltog i bogmesser i Athen og Rhodos, og hver gang et skib ankom til havnen, blev alle de bøger, det medbragte, beslaglagt og kopieret, idet biblioteket beholdt originalerne og returnerede kopierne til skibsføreren. Dette er det bibliotek, hvor Pedanius Dioscorides muligvis har studeret. En stor del af biblioteket blev ved et uheld brændt ned i 48 f.v.t. under en borgerkrig, og selv om en filial af biblioteket, kendt som datterbiblioteket, fortsatte med at fungere syd for byen, blev det også ødelagt i 391 e.v.t., da den romerske kejser Theodosius I (347-395) beordrede ødelæggelse af alle hedenske templer.