I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Enzymatisk reaktion (billedet åbner i et nyt vindue)

Chymotrypsin er en serin-endopeptidase, der produceres af acinærcellerne i bugspytkirtlen. Chymotrypsin bliver aktiveret efter proteolyse af chymotrypsinogen af trypsin. Mens trypsin hydrolyserer ved lysin og arginin, spalter chymotrypsin selektivt peptidbindinger dannet af aromatiske rester (tyrosin, phenylalanin og tryptofan) (Hedstrom et al. 1992). Der findes to fremherskende former af chymotrypsin, A og B, i lige store mængder i oksekødspancreas. De er meget ens proteiner (80 % identiske), men har væsentligt forskellige proteolytiske egenskaber (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, og Gráf et al. 2004). Nedenstående oplysninger vedrører primært A-formen af chymotrypsinogen og chymotrypsin.

Historie:

I begyndelsen af 1900-tallet foreslog Vernon, at pancreatiske præparater kunne give anledning til en iboende aktivator af sine egne enzymer (Vernon 1901). Vernons eksperimenter med mælkeklumpning fastslog, at der var mindst to enzymer til stede, og at det ene var mere stabilt end det andet (Vernon 1902). Denne idé blev imidlertid ikke bredt accepteret før 1934, da Kunitz og Northrop bekræftede tilstedeværelsen af et enzym ud over trypsin og kaldte det chymotrypsin. De var i stand til at krystallisere chymotrypsin samt den inaktive forløber, chymotrypsinogen (Kunitz og Northrop 1934). I 1938 isolerede Kunitz forskellige aktive former af chymotrypsin og betegnede dem som alfa, beta og gamma (Kunitz 1938).

I begyndelsen af 1940’erne undersøgte Fruton og Bergmann yderligere chymotrypsinets specificitet og rapporterede om flere nye substrater (Fruton og Bergmann 1942). Jacobsen identificerede snart yderligere former af chymotrypsin og betegnede dem som delta og pi (Jacobsen 1947). I 1948 karakteriserede Schwert yderligere molekylvægtene af chymotrypsin og chymotrypsinogen.

I 1954 blev det første bevis for den tretrinsmekanisme for chymotrypsin, der hydrolyserer amid- og estersubstrater, rapporteret af Hartley og Kilby, der opstillede hypotesen om tilstedeværelsen af et acylenzymintermediat, hvilket senere viste sig at være sandt (Henderson 1970). I 1955 opnåede Laskowski et andet krystallinsk chymotrypsinogen og gav det navnet chymotrypsinogen B. I 1964 bestemte Hartley aminosyresekvensen af chymotrypsin A, som senere blev forfinet af Meloun et al. i 1966. I 1968 bestemte Smillie et al. aminosyresekvensen af chymotrypsin B, som viste 80 % sekvensidentitet med chymotrypsin A. I løbet af 1970’erne og 1980’erne blev der forsket for bedre at forstå virkningsmekanismen og identificere forskellene i aminosyresekvenserne mellem trypsin og chymotrypsin (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth og Polgár 1983 og Gráf et al. 1988).

I 1990’erne blev chymotrypsin oprenset fra andre kilder, herunder fra atlanterhavstorsk (Ásgeirsson og Bjarnason 1991) og kamel (Al-Ajlan og Bailey 1997). Man begyndte også at undersøge inhibitorer (Baek et al. 1990), og Frigerio et al. opklarede krystalstrukturen af bovin chymotrypsin med en opløsning på 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Nyere forskning har undersøgt foldning og denaturering af chymotrypsin over en række koncentrationer (Ghaouar et al. 2010), chymotrypsins interaktion med nanopartikelsubstrater (You et al. 2006, og Jordan et al. 2009) og forøgelse af chymotrypsins stabilitet ved konjugering til PEG-molekyler (Castellanos et al. 2005, og Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Specificitet:

Chymotrypsin aktiveres gennem spaltning af bindingen mellem arginin og isoleucin (R15 og I16) af trypsin, hvilket forårsager strukturelle modifikationer og dannelse af substratbindingsstedet (Sears 2010). Chymotrypsin adskiller sig fra trypsin ved, at trypsin kløver peptider ved arginin- og lysinrester, mens chymotrypsin foretrækker store hydrofobiske rester (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsin katalyserer fortrinsvis hydrolysen af peptidbindinger, der involverer L-isomerer af tyrosin, phenylalanin og tryptofan. Den virker også let på amider og estere af modtagelige aminosyrer. Chymotrypsins specificitet for store hydrofobiske rester kan forklares ved en hydrofob S1-bindingspukkel, der er dannet af resterne 189 til 195, 214 til 220 og 225 til 228 (Cohen et al. 1981).

Og selv om strukturen af trypsin og chymotrypsins S1-site kun viser en enkelt forskel (ved position 189), har site-directed mutagenese af trypsin og chymotrypsin ikke formået at udveksle specificiteter, hvilket tyder på, at den mekanisme, hvormed trypsin og chymotrypsin opnår substratspecifik katalyse, ikke er fuldt forstået (Steitz et al. 1969, og Gráf et al. 1988).

Molekylære egenskaber:

Chymotrypsin A og B har 80 % sekvensidentitet (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 og Gráf et al. 2004). Aminosyrerne i den katalytiske triade (H57, D102 og S195) er stærkt konserverede i sekvenserne af peptidaserne i familie S1 (Gráf et al. 2004). Serinen på position 214 er også meget bevaret i familien og er blevet foreslået som det fjerde medlem af den katalytiske triade (Ohara et al. 1989 og McGrath et al. 1992).

Sammensætning:

De tre aminosyrerester i den katalytiske triade (H57, D102 og S195) er essentielle for spaltning af peptidbindinger og er stabiliseret af hydrogenbindinger (Sears 2010 og Gráf et al. 2004). G193 og S195 udgør oxyanionhullet og interagerer med carbonylgruppen i den scissile peptidbinding og orienterer den til at danne det tetraedriske mellemprodukt (Rühlmann et al. 1973, Huber og Bode 1978, og Gráf et al. 2004).

Proteinaccessionsnummer: P00766

CATH-klassifikation (v. 3.3.0):

• Klasse: Primært Beta
• Arkitektur: Beta-tønde
• Topologi: Trypsin-lignende serinprotease

Molekylvægt:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

Optimal pH: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Isoelektrisk punkt:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, teoretisk)
• 8,33 (Chymotrypsin, teoretisk)

Extinktionskoefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (teoretisk)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Teoretisk)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, teoretisk)

Residualer på det aktive sted:

• Histidin (H57)
• Aspartat (D102)
• Serin (S195)

Aktivatorer:

• Cetyltributylammoniumbromid (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammoniumbromid (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammoniumbromid (Spreti et al. 2001)

Inhibitorer:

• Hydroxymethylpyrroler (Abell og Nabbs 2001)
• Boronsyrer (Smoum et al. 2003)
• Courmarinderivater (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehyder (Lesner et al. 2009)
• Peptider fra naturlige kilder (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001 og Chopin et al. 2000)
• Peptider, der indeholder en unaturlig aminosyre (Legowska et al. 2009, og Wysocka et al. 2008)

Anvendelser:

• Sekvensanalyse
• Peptidsyntese
• Peptidkortlægning
• Peptidfingerprinting