MYC-amplifikation nedsætter overlevelsen på tværs af flere menneskelige maligniteter

En af de vigtigste TF’er, der regulerer celleproliferation hos pattedyr, er myelocytomatoseviralt onkoprotein (MYC), hvis funktion er bevaret på tværs af evolutionære hierarkier27,28,29,29,30,31. Fysiologisk set afløses MYC-reguleret proliferation af programmer til differentiering af linjetilstande, der modvirker MYC for at afslutte proliferationen20. Vi analyserede MYC-forandringer ved hjælp af to metoder. For det første analyserede vi copy number (CN) ændringer ved MYC locus ved hjælp af TCGA og ICGC data tilgængelige gennem cBioPortal platformen og fandt hyppige amplifikationer og gevinster af MYC (Fig. 1a). Vi fik derefter adgang til TCGA-pan-cancer (PANCAN) data, der indeholder 11.000 patienter på tværs af 33 af de mest udbredte tumorer, og analyserede dem gennem Xena Browser. MYC var stærkt amplificeret på tværs af disse maligniteter8,10. I begge datasæt blev MYC CN-ændringer bestemt ved hjælp af GISTIC-score-metoden, hvor værdierne -2,-1,0,0,1,2 repræsenterede homozygot deletion, heterozygot deletion, diploid, amplifikation på lavt niveau eller amplifikation på højt niveau32. Vi udførte derefter en overlevelsesanalyse ved hjælp af GISTIC-scorer, der forudsiger low level deletion/wild-type MYC, vs. gain/amplifikation ved hjælp af PANCAN-datasættet. MYC-amplifikation korrelerede med nedsat samlet overlevelse (p < 9,784 × 10-11, n = 2628) sammenlignet med tilfælde med MYC CN WT/low level-deletioner (n = 1352) (Fig. 1b). Vi analyserede derefter sammenhængen mellem GISTIC-scoringer på MYC-lokus vs. MYC mRNA-ekspression og patientoverlevelse. Der var en stærk korrelation (spearman r = 0,3339, p < 0,0001, n = 9697) mellem MYC GISTIC-score og MYC mRNA-ekspression (fig. 1c). Høje (n = 1762) vs. lave n = 1776) MYC mRNA-niveauer var forbundet med nedsat (p < 5,609 × 10-8) samlet overlevelse (Fig. 1d). Således er MYC et vitalt onkogen på tværs af mange menneskelige maligniteter, og identifikation af mekanismer til at modvirke MYC i kræft kunne have terapeutiske anvendelser. MYC-funktionen er bevaret på tværs af evolutionære hierarkier27,28,29,29,30,31. Protozoernes simple livscyklus kræver MYC for at generere datterceller, der ligner deres forældreceller ved hver celledeling27,29. Evolutionen fra encellede organismer til flercellede organismer førte til intensiv brug af energi til at åbne kromatinet og eksponere nøgent DNA, der gør det muligt for lineage TF’er at binde og aktivere hundredvis af terminale differentieringsgener, der styrer cellens skæbne og specialisering i forskellige cellelag. Denne proces kræver ikke aktivt prolifererende celler. Derfor er MYC-medieret proliferation potent modvirket på dette stadium33,34 (fig. 1e). Denne form for potent MYC-antagonisme er også nødvendig for eksistensen af multi-cellularitet29,35. Overbevisende nok øger infektion af multicellulære organismer med protozoaparasitter transformationen af inficerede celler til proliferative celler ved hjælp af komplekse mekanismer, der aktiverer MYC-protein og undertrykker differentierings-TF’er27,29,36.

I modsætning til normale celler gennemgår maligne celler proliferation uden terminal-differentiering (fig. 1e, f). Denne afvigende proces er stærkt afhængig af stabilisering af MYC og dets co-proteiner, der modulerer cellevækst og celledeling17,20,37,38,39. Genetiske og epigenetiske ændringer sikrer, at der sker en vedvarende proliferation af stamceller, der er afstamningsbestemte progenitorer, uden endelig differentiering i kræftceller (fig. 1e)7. For det første opnås vedvarende proliferation ved konsekvent opregulering og kromosomforøgelse af det genetiske locus, der koder for MYC-genet, på tværs af menneskelige maligniteter (fig. 1a). MYC-amplificering forudsiger dårlig samlet overlevelse (LogRank p-værdi = 9,784 × 10-11, n = 3980) (fig. 1a, b). I undersøgelser, der anvender genetisk manipulerede musemodeller (GEMM) eller xenograftmodeller af kræft, opretholder antagonisering af MYC tumorregression på tværs af flere tumorer39,40,41. For eksempel udviklede Shachaf et al. en transgen musemodel, der betinget udtrykker MYC i hepatocytter ved hjælp af tetracyklin-kontrolleret ekspression39. Inaktivering af Myc inducerede regression af murin HCC, hvilket øgede hepatocytter og hepatobiliær celledifferentiering, tab af HCC-markør α-fetoprotein og undertrykte proliferation39. I en xenograft PDAC-model målrettede Zhang et al. MYC-MAX dimerisering med et lille molekyle (10058-F4), der forstyrrer MYC-transkriptionel aktivitet40. Tilføjelse af 10058-F4 til gemcitabin førte til en drastisk dæmpning af tumorigenese sammenlignet med behandling med et enkelt middel40. Ved hjælp af en Kras-drevet musemodel af lungekræft målrettede Soucek et al. MYC ved hjælp af en dominant negativ MYC-dimeriseringsdomænemutant, der afbryder MYC-bindingen til det kanoniske Myc E-box-responselement “CACGTG” og derved hæmmer MYC-transaktiveringsaktiviteten41. Hæmning af MYC-transaktivering øgede musenes overlevelse ved at standse væksten af lungekræft41.

Fra et translationelt perspektiv er der forskellige udfordringer i forsøget på at målrette MYC direkte farmakologisk42. Den vigtigste udfordring er, at proliferation er et træk ved normale progenitors, og at en sådan behandling kan have et dårligt terapeutisk indeks20. Desuden har tumorer heterogene genetiske baggrunde, der bidrager til vedvarende MYC-aktivitet. For at forstå de mekanismer, der modvirker overdreven MYC-aktivitet, er det derfor bydende nødvendigt at definere de evolutionært bevarede fysiologiske metoder, hvormed normale progenitors modvirker MYC for at slukke for intens proliferation, og hvordan disse kan genoprettes i kræft.

Terminering af proliferation ved at aktivere apoptose er giftigt for normale celler, der deler sig

For at bevare samhørighed og integritet mellem forskellige celletyper har multicellulære organismer udviklet et system af kontrol og balance, der kollektivt er kendt som apoptose43,44. Apoptosens master TF’er p53 (TP53) og dets cofaktor p16 eller p14ARF (CDKN2A) spiller afgørende roller ved at standse prolifererende celler for at muliggøre reparation af skader eller ved at iværksætte et velordnet selvmord, hvis sådanne skader ikke kan repareres45,46. Under embryogenese nedreguleres ekspressionen af p53, måske fordi embryonale stamceller selvfornyes uden eksponentiel proliferation47,48,49. Funktionelle undersøgelser af differentiel ekspression af p53 ved hjælp af reporterassays viste højere ekspression på senere udviklingsstadier og nedsat ekspression i terminalt differentierede celler48. Under celledeling modvirker p53-veje potent MYC-veje for at standse proliferationen, så beskadigede celler kan repareres; uoprettelige celler undergår selvdestruktion gennem irreversibel apoptose for at beskytte hele organismens integritet43. Da p53-knockout (KO)-mus har normal udvikling og er ikke forstørrede50 , illustrerer dette, at apoptoseveje ikke er de dominerende mekanismer, som lineage-progenitorer anvender til at afslutte eksponentiel proliferation. Mus med dobbelt KO af Trp53 og Phosphatase and tensin homolog (Pten) udvikler således gliomtumorer ved at undlade at modvirke MYC, men denne fænotype observeres kun i Trp53- og Pten-dobbelt knockouts45,46. I PDAC er den hyppigste genmutation KRAS den hyppigste genmutation (~92 %). GEMM’er, hvor mutant KRAS (KC-mus) udtrykkes i bugspytkirtelceller, udvikler PDAC i 30 til 40 % af tilfældene i en alder af ~8-12 måneder51. Tilføjelse af mutant Trp53 til ovennævnte GEMM (KPC-mus) øger PDAC-penetrancen og mindsker overlevelsen til ~5 måneder, mens KC-mus med Ink4a-deletion overlever i ~2-3 måneder52,53. Mus med mutant Trp53 alene uden mutant Kras udvikler ikke PDAC53. I musemodeller for ovariecancer er det derimod blevet påvist, at inaktivering af Trp53 resulterer i invasive tumorer, men tumorudviklingen accelereres hos mus med samtidig inaktivering af Brca1 og Trp5354.

TP53 og CDKN2A er hyppigt bi-allelisk inaktiveret på tværs af humane maligniteter (Fig. 2a). En sådan inaktivering har stor betydning for behandlingen7. For at afslutte malign proliferation sigter konventionelle kemoterapeutika mod at opregulere p53/p16 ved at fremkalde cytotoksisk stress, der efterligner fysiologiske aktivatorer af denne vej55. Da maligne celler og normale celler eksisterer i det samme miljø, har en sådan behandling et ugunstigt terapeutisk indeks, da disse gener er muterede/fysisk utilgængelige i maligne celler, men intakte i normale celler. Der er blevet undersøgt flere metoder til at genindføre apoptose i kræftbehandling, men det har været vanskeligt at løse dette grundlæggende problem med det terapeutiske indeks56. Fremskridt inden for genomiske teknikker viser, at når TP53/CDKN2A-generne er wild-type, som i testikelkræft, giver behandling med cytotoksisk kemoterapi (f.eks. cisplatin) fuldstændige responser, der øger den samlede og sygdomsfri overlevelse57 (fig. 2a og b). Maligniteter med en høj grad af TP53/CDKN2A-inaktivering udviser ikke disse responser, hvilket fører til resistens over for flere apoptosebaserede behandlinger (bred kemoresistens og radioresistens) (fig. 2a, b, e, f)7. Selv forskellige tumortyper, der stammer fra det samme organ, reagerer bedre på behandling, hvis apoptosegenerne er intakte. F.eks. forekommer TP53- og CDKN2A-mutationer i henholdsvis ~70 og 90 % af PDAC58 (fig. 2a). Den samlede 5-årsoverlevelsesrate for PDAC er ~9 %, selv når man medtager patienter, der behandles med kemoterapi eller kombinationsbehandlinger og/eller kirurgi59,60. I modsætning hertil har pancreatiske neuroendokrine tumorer (PNET’er) generelt ikke TP53-mutationer, viser kun minimale deletioner af CDKN2A61 og har en 5-års overlevelsesrate på >50 %, når de behandles med apoptoseinducerende behandling62. På samme måde udviser glioblastoma multiform (GBM) en række forskellige kliniske, histopatologiske og molekylære karakteristika og har TP53-mutationer i ~30 % af de primære tilfælde og ~65 % af de sekundære GBM63,64. Gliomceller med WT TP53 reagerer på cytotoksisk stress induceret af klinisk tilgængelige kemoterapeutiske midler sammenlignet med celler med transkriptionelt tavsede mutante TP5365,66,67. I den Trp53-inducerede musemodel af PDAC (KPC) gør genetisk inaktivering af en allel af Myc desuden den terapeutiske respons på gemcitabin følsom40. Vi analyserede derfor genomiske data ved at sammenligne de ti bedste maligniteter med en forhøjet frekvens af TP53/CDKN2A-ændringer (TP53/CDKN2A-high) med de ti nederste maligniteter med lavfrekvente TP53/CDKN2A-ændringer (TP53/CDKN2A-low) (fig. 2b, c) (fig. 2b, c). Vi fandt, at 7/10 af TP53/CDKN2A-high-kræftformerne havde et fald i den sygdomsfri og samlede overlevelse, når disse gener var muteret (Fig. 2b; Tabel S1) (p-værdier < 0,05). Tilsvarende var der selv i TP53/CDKN2A-lav tilfælde et fald i sygdomsfri og samlet overlevelse, når disse gener blev ændret (p-værdier < 0,05) (Fig. 2c; Tabel S1) (Fig. 2c; Tabel S1). Således er ændringsraten i apoptosegener lavere i helbredelige maligniteter (testikelkræft/pædiatrisk ALL) sammenlignet med højt refraktære/behandlingsresistente kræftformer (PDAC/HCC) (Fig. 2g). Under fysiologisk modning inducerer WT TP53 irreversibel apoptose af usunde celler for at bevare integriteten af hele organismen (fig. 2h). I modsætning hertil muterer onkogen udvikling mediatorer for apoptose, hvilket fører til resistens over for apoptoseinduktion (Fig. 2h).

Genetiske og epigenetiske ændringer af differentieringsgener i kræft

De mest aggressive humane maligniteter er dårligt differentierede13. Selv om differentiering bidrager til dårlig overlevelse på tværs af flere menneskelige maligniteter, er de mekanismer, der ligger til grund for differentieringshindringerne i maligne celler, for det meste uklare, men ny viden er ved at dukke op5,6,7. Vi identificerede centrale lineage master TF’er for udviklingen af æggestokkene, bugspytkirtlen og leveren ved hjælp af offentliggjorte undersøgelser af lineage konvertering eller undersøgelser med transgene musemodeller6,68,69,70,71,72,73,74 (tabel 1). Programmer for celledifferentiering og linjeforpligtelse er dikteret af denne håndfuld master-TF’er og deres cofaktorer. Selv om flere cofaktorer har vigtige roller, er de mest vitale af disse transkriptionelle coaktivatorer og corepressorer, der bruger ATP til at remodellere kromatin for at tænde eller slukke for målgener33,34,75. Derfor analyserede vi de genetiske ændringer i lineage TF’er, deres coaktivatorer og corepressorer i OVC, PDAC og HCC (tabel 1).

Da maligne celler ikke helt kan undertrykke differentiering, da den er et kontinuum, som alle celler eksisterer langs, er master TF’er, der specificerer engagement i forskellige lineager, næsten aldrig helt inaktiveret ved mutation, men er ofte haploinsufficiente (fig. 3a; tabel 1). Denne dosisreduktion er tilstrækkelig til at standse fremskridt langs differentieringskontinuumet på dets mest proliferative punkter5,6,7. F.eks. var FOXL1 tab hyppigt i OVC (fig. 3a), og hyppigheden af FOXL1 tab var højest i dårligt differentierede OVC (fig. 3b). Dette mønster var tilsvarende for GATA4 i PDAC og HCC, selv om disse maligniteter havde et lille antal patienter, der overlevede efter stadie I og II (fig. 3b, c). Vi identificerede vigtige interaktionspartnere, der er coactivatorer og corepressorer af forskellige lineage-specifikke TF’er (tabel 1) ved hjælp af litteraturanalyse og data deponeret i UniProt-databasen (http://www.uniprot.org/). For at forstærke den fastlåste differentiering blev coaktivatorerne fundet hyppigt inaktiveret og slettet (Tabel 1; Fig. 4a), hvilket fremmer undertrykkelse af nedstrømsgener, der er målrettet mod nøgle-TF’er. Nye beviser tyder nu på, at sådanne ændringer forringer de veje, der formidler terminal differentiering6,7,76. Tidlige opdagelser af funktionerne af disse koaktivatorenzymer viste, at deres rolle i fysiologien var at udnytte ATP til at mobilisere histon-DNA-interaktioner, således at det nøgne DNA blev eksponeret, hvorved TF’er kunne binde til og aktivere målgener33,34,75,77. Denne proces er bevaret i evolutionen fra gær78, en af de enkleste metazoer, til homo-sapiens77. Inaktivering af disse gener i kræft kan være et forsøg på at forringe koaktivatorernes evne til at eksponere DNA for master-TF’er, der aktiverer nedstrømsgener. Et vigtigt fingerpeg om denne hypotese er, at lineage master TF’er er selektive i deres brug af specifikke koaktivatorer til at formidle aktivering af lineage gener (tabel 1). Et andet fingerpeg er, at maligne celler har en tendens til at miste en allel af liniespecificerende TF’er, en begivenhed, der kan være tilstrækkelig til at muliggøre liniebinding, men utilstrækkelig til terminal differentiering6,7 (fig. 3a; tabel 1). For eksempel kræver leverprogenitorer samarbejde mellem GATA4 og FOXA1 for at rekruttere koaktivatorer (f.eks. ARID1A) og formidle aktivering af hepatocytdifferentieringsgener. I HCC er heterozygot tab af GATA4 hyppigt (68 %, n = 366, fig. 3a; tabel 1), og inaktiverende mutationer i ARID1A er almindelige (44 %, n = 366, fig. 4a; tabel 1)6. Leverdifferentieringen er nedsat og proliferationen forstærket i lever med Gata4- eller Arid1a-leverbetinget haploinsufficiens6,76,79. Desuden aktiverer genindførelse af GATA4 i GATA4-mangelfuldt HCC eller ARID1A i ARID1A-muteret men GATA4-intakt HCC hundredvis af hepatocyt-epitheldifferentieringsgener6. De vigtigste TF’er i bugspytkirtellinjen omfatter GATA4 og GATA680,81. Der ses tab af kopiantal af en allel af disse faktorer i PDAC, og der er også observeret tab af funktionsmutationer i koaktivatorer (tabel 1; figur 3a, 4a). PDAC’er udviste imidlertid også en høj forekomst af amplifikation eller forstærkning af GATA4 og GATA6, hvilket tyder på, at disse TF’er i visse tilfælde kan give en vækstfordel til bugspytkirtelkræftceller. I OVC er en allel af ovariemester-TF’erne FOXL182,83 hyppigt tabt (80 %, Fig. 3a; Tabel 1 n = 316), mens koaktivatorer, såsom ARID3A og ARID3B, ofte er inaktiveret (Tabel 1; Fig. 4a). I kernen af malign transformation øger differentieringshindring således rutinemæssigt den maligne proliferation og opnås gennem haploinsufficiens af master-TF’er og inaktivering af de koaktivatorer, de bruger. Denne forståelse kan føre til behandlinger, der sigter mod at genindføre fremadrettet differentiering som et alternativ til apoptose som et middel til at afslutte malign proliferation.

Corepressorenzymer: nye mål for differentieringsgenoprettende onkoterapi

En enhanceosom består af multiproteinkomplekser, der samarbejder om at aktivere gener af en given slægt84,85, f.eks, hepatiske enhanceosomer aktiverer hepatocytgener6, mens pancreas- og ovarieforstærkningsosomer aktiverer henholdsvis pancreatiske86 og ovariegener87. Genetisk forstyrrelse af dette samarbejde kan flytte indholdet af disse proteinhubs væk fra koaktivatorer til corepressorer, der i stedet undertrykker slægtsgener76,88,89. En sådan repression muliggøres yderligere af den iboende lukkede kromatinstatus for terminal-differentieringsgener i modsætning til iboende åbent kromatin ved proliferations- og tidlig-differentieringsgener6,7,90.

For at eksponentiel proliferation kan finde sted afkoblet fra fremadrettet differentiering, er en høj grad af corepressoraktivitet nødvendig for epigenetisk silencing af liniedifferentieringsgener. Derfor observeres aberrant corepressoraktivitet ofte i maligne celler, hvor hundredvis af terminale differentieringsgener har ophobning af aktive corepressorer6,89. I modsætning til coaktivatorer, som ofte er inaktiveret ved genetiske mutationer/deletioner6 , er corepressorer ofte enten wild-type eller forstærket i maligne celler (tabel 1; fig. 4b). DNA-methyltransferase 1-enzym (DNMT1) er en corepressor for master TF og også den vedligeholdelsesmethyltransferase, der rekapitulerer CpG-methylering på den nysyntetiserede DNA-streng, når cellerne gennemgår delingscyklusser91,92,93. I TCGA PANCAN-data er høje niveauer af DNMT1 forbundet med dårlig overlevelse (p < 0,00001, n = 5145), sammenlignet med tilfælde med lave DNMT1-niveauer (n = 5199) (Fig. 5a). Dette tyder på en vigtig rolle for dette enzym i mange menneskelige kræftformer. Derfor har der i det sidste årti udviklet sig flere undersøgelser, der har forsøgt at udvikle terapeutiske interventioner, der er rettet mod DNMT1 i kræftbehandling94,95,96,97,98,99,100,100,101,102. På samme måde samarbejder Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1, (UHRF1) tæt med DNMT1 i reguleringen af DNA-methylering103,104. Vi analyserede ekspressionsniveauerne for UHRF1 i PANCAN-datasættet og fandt, at høje UHRF1-ekspressionsniveauer (p < 0,0001, n = 5150) i høj grad forudsagde dårlige overlevelsesrater sammenlignet med lave niveauer (n = 5189) (fig. 5b), hvilket illustrerer betydningen af disse methyleringsgener i humane kræftformer.

DNMT1-depletion uden cytotoksicitet har terapeutiske fordele selv i myelodysplastisk syndrom (MDS) og akut myeloid leukæmi (AML), der indeholder p53-systemdefekter102,105, og der er flere kliniske forsøg i gang med henblik på at evaluere DNMT1-depletion mere bredt i kræftbehandling (selv om decitabin og 5-azacytidin, der anvendes til at deplete DNMT1, har farmakologiske begrænsninger, som kan underminere deres evne til at deplete-DNMT1 fra solide tumorer) (Tabel 2). Ved akut promyelocytisk leukæmi (APL) opnås komplette remissioner ved at kombinere arsen med retinsyre for at hæmme corepressorer, der rekrutteres på leukæmifusionsproteinet PML-RARA106,107. Da co-repressorer ikke er muterede og har aberrant aktivitet i kræft, er de tilstrækkelige og logiske molekylære mål, der kan engagere terminale differentieringsgener for p53-cellecyklusudgange7,89,89,99,100,102,105,108,109,110,111 (tabel 2; fig. 5c, d).

Flere andre corepressorer er også blevet undersøgt som potentielle molekylære mål for epigenetisk behandling af kræft. For eksempel er histon deacetylase (HDAC)-enzymer (histone deacetylase) vigtige corepressorer, der rekrutteres til TF-hubs i mange menneskelige maligniteter og er kendte epigenetiske undertrykkere af genekspression5,6,88,89. I mange prækliniske undersøgelser er HDAC-enzymer blevet undersøgt som potentielle induktorer af celledifferentiering94,95. Et problem med målretning af HDAC’er er imidlertid deres plejotropiske cellulære funktioner – selv on-target-aktivitet kan således give utilsigtede bivirkninger. Andre almindelige corepressorer, der er opreguleret i mange humane maligniteter, er lysin-demethylaseenzymer såsom KDM1A (fig. 4b). Forskellige undersøgelser har påvist differentieringsinduktion ved farmakologisk målretning af KDM1A, og relaterede kliniske forsøg er i øjeblikket i gang112,113,114,115,116. Ved hjælp af en pan-cancer in vivo-screening med høj gennemløbskapacitet påviste Carugo et al. for nylig en forbindelse mellem corepressoren WDR5 og vedvarende MYC-medieret proliferation af PDAC117. Forstyrrelse af WDR5 gennem hæmningsassays førte til standset tumorprogression og øget overlevelse i PDX-musemodeller af PDAC117. I denne systematiske gennemgang har vi dokumenteret yderligere corepressorer, der rekrutteres til master TF-hubs i mange humane maligniteter, som kræver yderligere genetisk og farmakologisk validering som molekylære kandidatmål, der øger differentieringen. Disse omfatter HES1, BAZ1A/B, BAZ2A, EED, SUZ12 og UHRF1 (fig. 4b, 5b; tabel 1). Desuden blev opregulering af disse corepressorer fundet forbundet med avancerede kliniske patologiske stadier, hvilket tyder på en direkte virkning på differentieringsundertrykkelse. F.eks. blev HES1 fundet som den hyppigst opregulerede corepressor i OVC (fig. 4b), og OVC i stadie III og IV havde større HES1-vækst sammenlignet med stadie I og II (fig. 4c). HES1-hæmningsbehandling kan således være afgørende for OVC-differentieringsbehandling. Dette mønster blev også set for BAZ1B i PDAC og KDM1B i HCC (fig. 4b, d, e). Disse observationer tyder på, at i disse maligniteter kan målretning af disse nøgleenzymer til differentieringsinduktion give yderligere terapeutiske strategier, der omgår p53-systemdefekter.