2.19.2.3.3.3 Elutionsbetingelser
Effektive elueringsløsninger bør ideelt set forstyrre interaktionerne mellem analysand og antistof uden at påvirke de immobiliserede Abs negativt. En fortrænger er et højkoncentreret krydsreagerende molekyle, der er i stand til at fremkalde en biospecifik desorption. Displacer-molekylerne konkurrerer med de bundne analytmolekyler, og det store overskud af displacer-molekyler sikrer en kvantitativ desorption af analysanden. For at opnå optimale resultater skal fortrængeren opfylde flere kriterier: (1) en høj krydsreaktivitet med de immobiliserede antistoffer, (2) en retentionstid, der adskiller sig væsentligt fra analyttens, fordi det store overskud forårsager en fremtrædende top, der let kan forstyrre detektionen af analytten, (3) god stabilitet og høj renhed, fordi urenheder i så lave niveauer som 0,01-0,1 % kan forstyrre kromatogrammet, og (4) lav pris, ikke-toksiske egenskaber, fravær i rigtige prøver og lav detekterbarhed i forhold til analytten. Desuden er det nødvendigt med en stor mængde elueringsopløsning, hvilket kræver rekoncentration på et klassisk SPE-substrat før analyse. Derfor foretrækkes elueringsbetingelser, der muliggør fuldstændig genvinding af målanalytten med et lille elueringsvolumen.
Chaotropiske ioner anvendes almindeligvis til eluering af store molekyler som f.eks. proteiner. Disse ioner forstyrrer vandstrukturen omkring store molekyler, dvs. antistoffer og målmolekyler, hvilket medfører en brud på de hydrofobiske interaktioner i store molekylers strukturer og mellem analysanden og antistoffet. De mest almindelige chaotropiske ioner er chlorid-, jodid-, perchlorat- og thiocyanat-ioner i koncentrationer på mellem 1,5 og 8 mol l-1. De forskellige vandige opløsninger, der med succes kan anvendes til desorption af proteiner fra IS, har imidlertid vist sig at være ude af stand til at desorbere små molekyler. Desorptionen af proteinet er sandsynligvis hovedsagelig baseret på ændringer i det bundne proteins struktur (delvis denaturering) og ikke på ændringer i strukturen af de immobiliserede antistoffer. Derfor kræver elutionen af de små molekyler, som ikke er følsomme over for denaturering, meget strengere betingelser. Desuden kan dissociationskonstanten for antistof-analyt-interaktioner øges med to størrelsesordener ved en temperaturstigning fra 4 til 43 °C. Denne metode er ikke tilstrækkelig effektiv til at blive anvendt til eluering af små molekyler. Elution med opløsninger med lav pH-værdi udføres ofte for at desorbere små molekyler fra IS, men der kræves tre pH-enheder fra det isoelektriske punkt for antistoffet. Ved denne form for eluering (forskydning af pH-værdien uden ændring af ionstyrken) undgår man at beskadige labile antistoffer. En ulempe er, at der stadig kræves store mængder til fuldstændig desorption, hvilket mindsker de berigelsesfaktorer, der er forbundet med ekstraktionsprocedurerne.
En effektiv eluering af små molekyler fra en IS kan opnås med en reduceret mængde af en blanding af vand og organisk modificator. Som et eksempel viser figur 6 elueringsprofilen for to herbicider, isoproturon og atrazin, efter perkolation af en vandprøve, der er tilsat hver analysand, på den tilsvarende IS. Flere elueringsopløsningsmidler (methanol, ethanol og ACN) blandet med vand blev evalueret.
Figur 6. Elutionsprofiler for atrazin, isoproturon, 2,4,6-trichlorphenol og pentachlorphenol fra deres tilsvarende IS ved hjælp af elueringsopløsninger indeholdende stigende mængder af et organisk opløsningsmiddel i syrnet eller ikke-syret vand efter perkolation af vandprøver tilsat hver analysand. ACN, acetonitril; MeOH, methanol; EtOH, ethanol; AA, eddikesyre; TFA, trifluoreddikesyre.
De resulterende elueringsprofiler afhænger i høj grad af opløsningsmidlets beskaffenhed. De tre testede opløsningsmidler giver mulighed for fuldstændig eluering af begge analyter. ACN har dog den højeste elueringsstyrke: det laveste indhold af dette opløsningsmiddel giver fuldstændig eluering af begge analyter. Et ACN-indhold på 40 % og 60 % er tilstrækkeligt til at genvinde henholdsvis isoproturon og atrazin, mens 60 % og 80 % methanol er nødvendigt. I dette tilfælde synes opløsningsmidlets elueringsstyrke at være relateret til dets hydrofobiske karakter, idet ACN (Hildebrand-opløselighedsparameter δ = 24,3 MPa1/2) er mindre polært end ethanol (δ = 26,0 MPa1/2) og methanol (δ = 29,7 MPa1/2). Disse resultater synes at indikere, at interaktionerne mellem herbiciderne og deres tilsvarende antistoffer primært er hydrofobiske af natur. Tilstedeværelsen af upolære opløsningsmidler reducerer den hydrofobiske bindingskomponent i interaktionen mellem antistof og analyt. Det påvirker imidlertid også stabiliteten af de hydrofobiske bindinger, hvorved antistofets tertiære struktur bevares, og resulterer i frigivelse af antigenet. Disse eksempler vedrørende eluering af atrazin eller isoproturon fra deres tilsvarende IS viser, at der opnås en effektiv eluering ved direkte tilsætning af en stor mængde methanol eller ACN, 70-80 %, i elueringsfraktionen. Denne store mængde organisk modificerende stof gør det muligt at reducere elueringsfraktionens volumen så meget som muligt og dermed at koncentrere analysanden i eluatet. Det skal sikres, at valget af bindingsmåde er foreneligt med disse elueringsbetingelser. Ved anvendelse af ikke-kovalent binding er det ikke muligt at anvende en så stor mængde modificator uden risiko for at forstyrre bindingen af antistofferne fra sorbentet. Anvendelsen af en sol-gel-proces til immobilisering af antistoffer begrænser også muligheden for at anvende en stor mængde organisk opløsningsmiddel. Det blev vist, at en stor mængde organisk modificator som f.eks. antistoffer forårsager udvaskning af antistoffer fra sol-gel-matrixen.8
Det er undertiden nødvendigt med en kombination af organisk opløsningsmiddel og organisk syre. Figur 6 viser også elueringsprofilen af 2,4,6-trichorophenol og pentachlorphenol fra en anti-pentachlorphenol IS ved anvendelse af en hydro-organisk blanding med og uden tilsætning af en syre til elueringsopløsningen. Trichlorphenol kunne genvindes fuldstændigt ved anvendelse af enten vand/ACN (20:80, v/v) eller vand/ACN (30:70, v/v), der var forsuret ved pH 3 med trifluoreddikesyre (TFA). Når forsuring blev opnået ved hjælp af 1% (v/v) eddikesyre (AA), var en blanding, der kun indeholdt 30% ACN, effektiv til eluering. Derimod var det umuligt at eluere pentachlorphenol, som har en højere affinitet for PAbs end trichlorphenol, med ren ACN eller ACN, der var forsuret med TFA. Desorptionen kunne kun opnås med vand/ACN 20:80 (v/v) indeholdende 1 % AA (v/v).
Derfor opnås desorption i de fleste off-line procedurer, herunder dem, der anbefales ved brug af kommercielle IS til engangsbrug, med en høj procentdel af et organisk opløsningsmiddel, undertiden ved lav pH.
Det kan konkluderes, at valget af elueringsbetingelserne først afhænger af affiniteten mellem antistofferne og analytterne. Det afhænger også af analyttens art på grund af forholdet mellem elektroniske og hydrofobiske interaktioner, der er involveret i antigen-antistof-interaktionerne. Endelig afhænger det af strategien for immobilisering af antistofferne; ikke-kovalent binding forhindrer brugen af store mængder organiske opløsningsmidler.