Abstract
Der beskrives en kvantitativ model for phenylalaninmetabolisme hos mennesker. Modellen er baseret på de kinetiske egenskaber af ren rekombinant human phenylalaninhydroxylase og på estimater af in vivo hastighederne for phenylalanin transaminering og proteinnedbrydning. De beregnede værdier for steady-state-koncentrationen af phenylalanin i blodet, hastigheden for clearance af phenylalanin fra blodet efter oral indtagelse af aminosyren og tolerance over for phenylalanin i kosten stemmer alle godt overens med data fra normale såvel som fra phenylketonuriske patienter og obligatoriske heterozygoter. Disse beregnede værdier kan være til hjælp ved beslutningen om den grad af begrænsning af phenylalaninindtaget, der er nødvendig for at opnå et tilfredsstillende klinisk resultat hos klassiske patienter og hos patienter med mildere former af sygdommen.
Det indledende og hastighedsbegrænsende trin i den fuldstændige katabolisme af phenylalanin til CO2 og vand er dets hydroxylering til tyrosin, en reaktion, der katalyseres af phenylalaninhydroxyleringssystemet. Systemet er komplekst og består af phenylalaninhydroxylase (PAH), pterincoenzymet tetrahydrobiopterin (BH4) og flere enzymer, der tjener til at regenerere BH4, dvs, dihydropteridinreduktase og pterin 4α-carbinolamin dehydratase (1, 2).
Men selv om phenylalanins benzenring ikke kan brydes uden først at blive hydroxyleret i para-positionen, kan aminosyrens alaninsidekæde metaboliseres selv i fravær af ringhydroxyleringstrinnet. Denne alternative vej indledes ved transaminering af phenylalanin til phenylpyruvat efterfulgt af omdannelse af sidstnævnte forbindelse til metabolitter som f.eks. phenyllactat, phenylacetat og o-hydroxyphenylacetat. Produkterne fra transaminasegangen udskilles i urinen. Trinene i disse alternative trin i phenylalaninmetabolismen er skitseret i fig. 1.
Det skal indledningsvis bemærkes, at et tidligere forsøg på at foretage en sådan analyse blev hæmmet af manglen på data om de kinetiske egenskaber af human PAH og human phenylalanin-transaminase. For sidstnævnte enzyms vedkommende vidste man ikke engang med sikkerhed, hvilket enzym der var ansvarlig for denne aktivitet in vivo. Da in vitro-beviserne viste, at phenylalanin er et fremragende substrat for mitokondriel aspartataminotransferase, blev det antaget, at det er denne transaminase, der er involveret. Da egenskaberne for den menneskelige modpart ikke var kendt, blev de kinetiske egenskaber for det tilsvarende enzym fra rotter anvendt (12). Den måde, hvorpå problemet med den humane transaminase blev håndteret i den foreliggende analyse, vil blive diskuteret nedenfor.
Kinetiske egenskaber for rekombinant humant PAH er nu tilgængelige (16, 17). PAH’s kinetik er noget kompliceret af det faktum, at phenylalanin ikke kun tjener som substrat for enzymet, men også som aktivator (se ref. 1 og henvisninger heri). Da en tidligere analyse af PAH’s kinetiske opførsel baseret på en to-site-model med ordnet binding af phenylalanin på både et katalytisk sted og et regulatorisk sted kunne redegøre tilstrækkeligt for mange ejendommelige aspekter af enzymets kinetiske opførsel (18), blev en lignende to-site-model med ordnet binding anvendt i den foreliggende analyse. Den faktisk anvendte hastighedsligning (19) er vist i Eq. 2, hvor Km er den koncentration af phenylalanin, der giver halvmaksimal hastighed, og Ka er den koncentration af phenylalanin, der giver halvmaksimal aktivering i et forsøg, hvor PAH blev præinkuberet med varierende koncentrationer af phenylalanin. Til denne analyse blev følgende kinetiske konstanter anvendt, som blev bestemt med rent rekombinant humant PAH ved 37 °C med BH4 som coenzym: Km for phenylalanin, 0,51 mM, og Ka for phenylalanin som aktivator, 0,54 mM (D. Kowlessur og S.K., upublicerede data). En omtrentlig værdi af Vmax for human PAH (16) (sandsynligvis en undervurdering) blev beregnet ud fra den indledende faldhastighed af serumfenylalaninniveauerne (0,9 μmol/ml pr. h) hos kontrolpersoner, efter at de havde modtaget en oral belastning af l-phenylalanin, der var tilstrækkelig til at øge deres serumfenylalaninniveauer med ≈17 gange (20). 
2 Som anført ovenfor blev det tidligere problem med identiteten af det enzym hos mennesket, der er ansvarlig for phenylalanin-transaminationen, omgået i den foreliggende analyse. Det blev antaget, at den vigtigste rute for nettoafskaffelse af phenylalanin hos klassiske PKU-patienter er via transaminering. F.eks. er urinudskillelsen af phenylalanin som allerede nævnt kun ≈11 % af den mængde, der transamineres, og ved udgangen af det første leveår kan det anslås, at den mængde phenylalanin, der bortskaffes via inkorporering i protein, kun er ≈25 % af den mængde, der bortskaffes via transaminering. Det skal bemærkes, at med den nuværende metode til estimering af fenylalanintransaminasehastigheden, som er baseret på hastigheden af clearance af fenylalanin fra blodet, indgår mindre reaktioner til bortskaffelse af fenylalanin, såsom urinudskillelse og inkorporering i protein, i estimeringen af transaminaseaktiviteten, hvilket resulterer i en lille overvurdering af denne aktivitet.
For at være anvendelig i den nuværende analyse er der behov for værdier for Km og Vmax for transaminasen. Der er gjort forsøg på at uddrage en Km-værdi for phenylalanin-transaminering fra resultaterne af phenylalaninbelastningstests udført på klassiske PKU-patienter (21). Den metode, der blev anvendt til at estimere en værdi for Vmax for det humane transaminationsenzym, var at anvende data om summen af alle transaminationsmetabolitter (dvs. phenylpyruvat, phenyllactat og o-hydroxyphenylacetat), der blev udskilt af en gruppe af klassiske PKU-patienter som en funktion af deres plasmafenylalaninniveauer. Den maksimale udskilte mængde, udtrykt som mmol/mol kreatinin, var 1.370, et niveau, der syntes at plateauere ved plasmafenylalaninniveauer mellem 1.200 og 2.400 μmol/liter (22).
Forsøg på at omregne denne værdi til en transamineringshastighed kompliceres af det store aldersspænd, ≈2 år til ≈18 år, i den patientprøve, der blev anvendt i undersøgelsen. I den foreliggende analyse blev det antaget, at patienternes gennemsnitlige kropsvægt var 50 kg, og at den daglige kreatininudskillelse var 2 g/24 h (23). Det blev endvidere antaget, at udskillelsen af transaminaseafledte metabolitter sker med en lineær hastighed i løbet af 24 timer og afspejler dannelseshastigheden af disse metabolitter. Det blev også antaget, at disse forbindelser er i ligevægt med alle kroppens væskekompartmenter undtagen tæt bruskbindingsvæv og knogle, som tilsammen udgør 15 % af det samlede kropsvand (24), hvilket giver et fordelingsvolumen for tilgængeligt vand på 500 ml/kg kropsvægt. På grundlag af disse antagelser blev den maksimale transaminationshastighed beregnet til 0,043 μmol/ml pr. h.
Et yderligere produkt af phenylalaninmetabolismen, der i det mindste delvist stammer fra phenylpyruvat, og som ikke blev målt i Langenbeck et al.’s undersøgelse (22), er phenylacetylglutamin (PAG). Der er beviser for, at PAG kan dannes fra phenylacetat, som er afledt af phenylpyruvat ved oxidativ decarboxylering (25). Det er også blevet foreslået, at phenylacetat og dermed PAG kan dannes fra phenylalanin ad en vej, der ikke indebærer transaminering, men i stedet indebærer decarboxylering til phenylethylamin efterfulgt af oxidation af aminen til phenylacetat (26). Konstateringen af, at den mængde phenylethylamin, der udskilles hos PKU-patienter, er lille, selv efter at oxidationen af aminen blev blokeret ved indgivelse af en inhibitor af aminoxidase (27), indikerer imidlertid, som tidligere diskuteret (12), at decarboxylering af phenylalanin er en kvantitativt mindre vigtig vej for phenylalaninmetabolisme såvel som for PAG-dannelse.
Mængden af PAG, der udskilles af normale personer, er 250-500 mg/dag; PKU-patienter udskiller dobbelt så meget (28). Med henblik på beregning af den mængde PAG, der dannes via transaminasevejen, blev det konservativt antaget, at kun den “ekstra” mængde, der udskilles af patienterne, stammer fra phenylpyruvat. Hvis man tager den gennemsnitlige ekstra mængde PAG, der udskilles, som 350 mg/dag og foretager de samme antagelser som dem, der er skitseret ovenfor, svarer denne udskillelse til en PAG-dannelseshastighed på 0,020 μmol/ml pr. time, hvilket bringer dannelseshastigheden for alle transaminerede produkter op på 0,063 μmol/ml pr. time.
Med anvendelse af denne værdi for Vmax blev resultaterne af phenylalaninbelastningstesten udført på klassiske PKU-patienter (21) anvendt til at beregne en værdi på 1.37 ± 0,14 mM (gennemsnit ± SD, n = 3) for Km for phenylalanintransaminase.
Da i den foreliggende analyse PAH- og transaminaseaktiviteterne beregnes som en funktion af phenylalaninniveauerne i blodet, er det vigtigt, at disse niveauer afspejler vævsniveauerne af aminosyren. Det er relevant i denne forbindelse, at phenylalaninniveauerne i levervæv fra en PKU-patient (29) og i lever- og nyrevæv fra hyperphenylalanæmiske rotter (30) er blevet rapporteret at være sammenlignelige med de tilsvarende niveauer i blodet.
Det tredje udtryk i ligning 2, nettoproteinnedbrydningshastigheden, blev estimeret ud fra data fra Waterlow og Jackson (31), som viser, at i fastende tilstand, den tilstand, under hvilken phenylalaninbelastningstesten udføres, er nettoproteinnedbrydningen (dvs, mængden af nedbrudt protein minus den syntetiserede mængde) er lig med 0,30 g/kg kropsvægt pr. 12 timer. Da skeletmuskulaturen udgør ≈40 % af kropsmassen (24), og proteinkatabolismen i dette væv spiller en vigtig rolle i leveringen af aminosyrer til periferien, blev proteinnedbrydningen i skeletmuskulaturen antaget som den fremherskende begivenhed i den nedbrydning af protein, der finder sted under faste.
Menneskelig skeletmuskulatur indeholder ≈46 μmol phenylalanin/g væv (32). På grundlag af denne værdi og den konstatering, at voksen menneskelig muskel indeholder 19,8 % protein (33), kan det anslås, at muskel indeholder 232 μmol phenylalanin/g muskelprotein. Hvis denne værdi tages som repræsentativ for kroppens proteinlagre, vil det indikere, at ≈70 μmol phenylalanin/kg kropsvægt pr. 12 timer vil blive frigjort i fasteperioden. På grundlag af de samme antagelser som dem, der blev gjort ovenfor ved vurderingen af fenylalanin-transamineringshastigheden, ville den sidste værdi udmønte sig i en timelønnet nettoproteinnedbrydningshastighed (og frigivelse af fenylalanin fra denne proces) på 0,012 μmol/ml pr. time. Da substratet for denne reaktion, dvs. kroppens proteinlagre, sandsynligvis ville forblive relativt konstant i en kort fasteperiode, blev det antaget, at proteinnedbrydningen fulgte en kinetik af nul-orden.
Substituerer man de anslåede værdier for de kinetiske konstanter for de tre reaktioner vist i ligning 1, fås ligning 3: 
3
RESULTATER OG DISKUSSION
Den generelle gyldighed af ligning 3 kan vurderes på flere måder. For det første blev basishastigheden af hydroxylationsreaktionen ved hjælp af udtrykket for hastigheden af den PAH-katalyserede reaktion, herunder de kinetiske konstanter, der er vist i ligningen, beregnet til 0,010 μmol/ml pr. h. Denne værdi stemmer godt overens med følgende rapporterede værdier for normale forsøgspersoner på grundlag af forsøg, hvor forsøgspersoner blev infunderet med l-phenylalanin: 0,013 μmol/ml pr. h; 0,008 μmol/ml pr. h (34); 0,012 μmol/ml pr. h (5); 0,010 μmol/ml pr. h (6). En værdi på 0,020 μmol/ml pr. h blev fundet i den sidste undersøgelse, da forsøgspersoner fik infusion af l-phenylalanin (6). De citerede in vivo-hastigheder for omdannelse af phenylalanin til tyrosin blev alle angivet som μmol/h pr. kg. De blev omregnet til μmol/ml pr. time på grundlag af de samme antagelser som tidligere, dvs. at volumenfordelingen af metabolitter som f.eks. phenylalanin er 500 ml/kg kropsvægt. Disse resultater viser, at den beregnede hastighed for phenylalaninhydroxylering stemmer godt overens med de eksperimentelt bestemte hastigheder.
En anden test af modellens validitet er at beregne steady-state blodphenylalaninniveauet for både kontrolpersoner og for PKU heterozygoter, som formodes at have 50 % af den normale PAH-aktivitet, samt t1/2 for clearance af en belastning af phenylalanin (dvs, den tid, der er nødvendig for, at den oprindelige koncentration af phenylalanin falder til halvdelen af sin oprindelige værdi) fra blodet for disse to grupper. Det stationære phenylalaninniveau for kontrolpersoner, beregnet ud fra Eq. 3 (ved at sætte udtrykket “-dPhe/dt” lig nul og beregne koncentrationen af phenylalanin), er 0,059 mM, og for personer med 50 % resterende PAH-aktivitet er det 0,079 mM, hvilket er 1,34 gange højere end kontrolniveauet. Selv om værdien 0,059 mM for normale personer stemmer godt overens med den accepterede værdi på 0,058 ± 0,015 mM (gennemsnit og SD) (35), synes værdien 0,079 mM for heterozygoter, som kan forventes at have 50 % af det normale PAH-niveau, at være for lav. Forholdet mellem blodets phenylalaninniveauer for kontroller og for obligatoriske PKU-heterozygoter er blevet rapporteret til at ligge i intervallet 1,57-1,61 (36-38) snarere end det forhold på 1,34, der blev forudsagt af modellen.
Denne beregnede værdi rejser muligheden for, at PKU-heterozygoter kan have mindre end 50 % af kontrol-PAH-aktiviteten. Ved at indsætte en værdi på 40 % af kontrol-PAH-aktiviteten for heterozygoter i Eq. 3 fås en steady-state fenylalaninkoncentration på 0,093 mM; ved anvendelse af denne værdi og værdien på 0,058 mM for kontrolpersoner fås et forhold på 1,60, hvilket er tæt på det interval, der er rapporteret for heterozygoter og kontrolpersoner (se ovenfor). I denne forbindelse skal det bemærkes, at den resterende PAH-aktivitet i leverbiopsiprøver fundet for seks HPA-obligatoriske heterozygoter varierede mellem 5,8 og 31 % af kontrolværdierne (39). Disse resultater gav den første indikation af, at HPA-heterozygoter har betydeligt mindre end 50 % af kontrolaktiviteten. To efterfølgende større undersøgelser af forældre til patienter med PKU var i overensstemmelse med disse tidligere resultater: en undersøgelse rapporterede en middelværdi på 29,3 % af kontrolværdierne (n = 9) (40) og en anden rapporterede en middelværdi på 28,1 % (n = 8) (41).
Modellen forudsiger også t1/2-værdier for clearance af phenylalanin fra blodet for både normale personer og heterozygoter, som er i overensstemmelse med de faktiske kliniske resultater. For normale personer fås en værdi på 65 min, hvilket er lavere end den rapporterede middelværdi på 89 min, men ligger godt inden for intervallet 60-120 min (10). For heterozygoter med 50 og 40% resterende PAH-aktivitet er t1/2-værdierne beregnet ud fra Eq. 3 henholdsvis 144 og 180 min sammenlignet med en rapporteret middelværdi på 159 min .
Der er tidligere henvist til en rapport om to HPA-patienter, hvis manglende evne til at metabolisere phenylalanin syntes at være et resultat af en mangel på transaminase (11), og til beviserne mod denne konklusion (12). Den foreliggende model giver en yderligere grund til at betragte denne påstand med skepsis. Fig. 2 viser tidsforløbet for forsvinden af 1 mM phenylalanin fra plasma fra en kontrolperson (kurve A) samt fra en person, der mangler transaminase, men har normale PAH-niveauer (kurve B). Som det ses, er de to hastigheder næsten de samme, hvilket gør det yderst usandsynligt, at udtalt HPA kan skyldes mangel på transaminase. Årsagen til, at de to hastigheder er næsten identiske, er, at hastigheden for forsvinden af phenylalanin ved totalt fravær af PAH (kurve D) er meget lille, idet den oprindelige hastighed kun er 2,6 % af den hastighed, der gælder for en kontrol med normale PAH-niveauer. Fig. 2 (kurve C) viser også hastigheden for bortskaffelse af phenylalanin hos et individ med 40 % af det normale PAH-niveau, et underskud af PAH-aktivitet, der som nævnt ovenfor kan repræsentere gennemsnittet for PKU-heterozygoter.
Beregnede clearancehastigheder af en belastning af phenylalanin for kontroller og for personer med forskellige genotyper. A, kontroller; B, person med nul transaminaseaktivitet; C, person med 40 % af kontrol-PAH-aktivitet; D, person med 0 % af kontrol-PAH-aktivitet.
For nylig blev PKU-patienter klassificeret ved at inddele dem i fænotypekategorier på grundlag af deres tolerance over for phenylalanin i kosten. Patienter med klassisk PKU tåler mindre end 20 mg/kg phenylalanin pr. dag for at holde deres phenylalaninniveauer i blodet på det accepterede niveau på 0,3 mM, patienter med “moderat PKU” tåler 20-25 mg/kg pr. dag, og patienter med “mild PKU” tåler 25-50 mg/kg pr. dag (42).
For at se, om disse toleranceværdier for phenylalanin i kosten er i overensstemmelse med forudsigelserne i henhold til Eq. 3, blev det antaget, at indtagelsen af den tilladte mængde phenylalanin blev fordelt ligeligt på tre “måltider”. For klassiske PKU-patienter med et indtag af fenylalanin på 15 mg/kg pr. dag ville hvert måltid indeholde 5 mg/kg pr. dag og ville tilføje 0,06 μmol/ml til basisværdien på 0,30 μmol/ml for et samlet plasmafenylalaninniveau på 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Ved at indsætte denne værdi i ligning 3 (under antagelse af, at Vmax for en klassisk PKU-patient er lig med nul) er -dPhe/dt lig med 0,001 μmol/ml pr. time, dvs. at ved dette phenylalaninniveau er hastigheden for forsvinden af phenylalanin via transaminationsreaktionen kun lige akkurat større end hastigheden for indførsel af phenylalanin i plasmapuljen via netto proteinnedbrydning. Derfor forudsiger Eq. 3, at disse PKU-patienter kunne tåle et fenylalaninindtag på 15 mg/kg pr. dag.
Udregnet på samme måde ville “moderat PKU”-patienter med en tolerance over for fenylalanin i kosten på 25 mg/kg pr. dag kræve en resterende PAH-aktivitet svarende til 15 % af wildtypens aktivitet for at metabolisere det i 3.5 timer. På samme måde ville “milde PKU”-patienter med en tolerance over for fenylalanin i kosten på 50 mg/kg pr. dag kræve et resterende PAH-niveau på 25 % af vildtype-niveauet for at metabolisere det tilsatte fenylalanin på ca. 3 timer.Disse resultater tyder på, at Eq. 3 kan redegøre for den tolerance over for phenylalanin i kosten, der ses i disse forskellige patientgrupper.
Det ville være nyttigt at forsøge at korrelere disse estimater af den resterende PAH-aktivitet for “mild PKU”- og “moderat PKU”-patienterne med den resterende hydroxylaseaktivitet målt in vitro for de mutante PAH-arter, som patienterne huser. På nuværende tidspunkt er et sådant forsøg imidlertid vanskeliggjort, fordi der er for stor spredning i in vitro-dataene. Således har flere patienter, der er klassificeret som havende “moderat PKU” (42), vist sig at have følgende tre mutantformer af PAH (med deres in vitro-resterende PAH-aktiviteter udtrykt som en procentdel af wild-type-aktiviteterne, angivet i parentes): L348V (25 %), R261Q (30 %, 47 %) og R158Q (10 %) (43). Det kan ses, at disse værdier varierer med næsten 5 gange. Som tidligere diskuteret (2, 43) har in vitro-estimater af resterende hydoxylaseaktivitet af PAH-mutanter generelt en tendens til at være højere end dem, der er observeret i leverbiopsier. Mindst en af årsagerne til denne tendens er, at in vitro PAH-aktiviteter sædvanligvis måles ved at anvende mættende koncentrationer af phenylalanin og BH4, som det blev gjort for mutant R261Q (44). I betragtning af denne situation er det muligt, at resterende PAH-aktiviteter, der er estimeret ved brug af Eq. 3, kan vise sig at være en bedre afspejling af in vivo-aktiviteterne end dem, der er målt in vitro.
Denne nuværende model for phenylalaninmetabolisme er relevant for den konklusion, som Thompson og hans kolleger (45, 46) nåede frem til på grundlag af resultater opnået ved infusion af forsøgspersoner med deuteriummærket phenylalanin og tyrosin, at klassiske PKU-patienter har en “betydelig” PAH-aktivitet, der svarer til ca. 76 % af kontrolpersonernes aktivitet. Denne forbløffende høje phenylalanin-hydroxylerende aktivitet blev tilskrevet tyrosinhydroxylase (45). Som allerede nævnt viser de resultater, der er opsummeret i fig. 2, at en dosis phenylalanin i fravær af PAH opløses fra blodet med mindre end 3% af den hastighed, der ses hos kontrolpersoner. Den foreliggende analyse tyder ikke på, at der findes nogen alternativ vej hos mennesker, som kan fjerne store mængder phenylalanin. For nylig har van Spronsen et al. (34) påpeget et potentielt metodologisk problem med den metode, der blev anvendt af Thompson og kolleger.
Sammenfattende er de kvantitative resultater, der er opnået med modellen for PAH-metabolisme, i overensstemmelse med data, der indirekte afspejler PAH’s in vivo aktivitet, såsom steady-state blodphenylalaninniveauer, clearancehastigheder (konventionelt udtrykt som t1/2-værdier) af phenylalanin fra blodet efter en belastning med phenylalanin og tolerance over for phenylalanin gennem kosten. Modellen har potentiale til kvantitativt at vurdere den resterende PAH-aktivitet ud fra enhver af disse værdier, især ud fra de målte hastigheder for clearance af en belastning med phenylalanin. De forudsagte resterende PAH-niveauer eller de værdier, der er afledt heraf, kan være nyttige i forbindelse med beslutninger om, hvor streng diætrestriktionen for phenylalanin skal være for at opnå det ønskede phenylalaninniveau i blodet. Tabel 1 opsummerer t1/2-værdierne og steady-state blodfenylalaninniveauerne beregnet ud fra ligning 3 (under forudsætning af ingen indtagelse af fenylalanin i testperioden) for forskellige niveauer af residual PAH-aktivitet samt sammenlignelige værdier fra relevante kliniske data.
- Se inline
- Se popup
Steady-state phenylalanin blodniveauer og t
værdier for clearance af phenylalnin beregnet ud fra Eq. 3 for forskellige niveauer af PAH
Footnotes
-
↵* Til hvem anmodninger om genoptryk skal rettes. e-mail: kaufman{at}codon.nih.gov.
ABKORVIATIONER
PAH, phenylalaninhydroxylase; PKU, phenylketonuri; HPA, hyperphenylalaninæmi; PAG, phenylacetylglutamin