Resultater og diskussion
To veje til Pt-oxidation i E. coli. Genetiske undersøgelser har vist, at enzymet C-P-lyase, der er kodet af phn-operonet, er i stand til at oxidere Pt (26). I en nylig undersøgelse (9) blev vi imidlertid overrasket over at observere, at nogle E. coli phn-mutanter fortsat var i stand til at oxidere Pt. Undersøgelse af genotypen af disse stammer tydede på, at phoA-lokussen kunne være involveret i Pt-oxidation. For at teste denne hypotese direkte undersøgte vi E. coli-stammer, der udelukkende adskilte sig i phn- og phoA-loci for deres evne til at oxidere Pt, som demonstreret ved deres evne til at vokse på medier med Pt som den eneste P-kilde. Da fosfat er nødvendigt for vækst, kan organismer ikke vokse på dette medium, medmindre de har evnen til at oxidere Pt til fosfat. Stammer, der enten var phoA + eller phn +, voksede på Pt-medium (uanset om det andet locus var muteret eller ej), mens stammer med mutationer i både phn og phoA ikke voksede på Pt-medium (fig. 1). E. coli har derfor to veje til oxidation af Pt: en, der er phn-afhængig, og en, der er phoA-afhængig.
Til støtte for denne hypotese påviste vi Pt-afhængig H2-produktion både in vitro og in vivo. In vitro-assays blev udført aerobt i forseglede hætteglas ved hjælp af højt oprenset BAP. Efter inkubation blev headspace analyseret for H2, og den vandige del blev analyseret for fosfat. Som det fremgår af fig. 2B , blev der produceret stoikiometriske mængder fosfat og H2 fra Pt i tilstedeværelse af BAP, mens der hverken blev produceret fosfat eller H2 i kontrolreaktioner, der enten indeholdt BAP eller Pt alene.
Produkterne af den BAP-katalyserede Pt-oxidation er fosfat og molekylært H2. A) De protonafkoblede 31P-kernemagnetiske resonansspektrer og toppositioner er angivet for 5 mM Pt og 5 mM fosfat-kontroller samt for en reaktion over natten, der oprindeligt indeholdt 5 mM Pt plus 500 μg oprenset BAP. En top for ureageret Pt og en ny fosfat-top er tydelig i spektret for den enzymatiske reaktion, men der blev ikke dannet andre produkter. Den lille forskydning i fosfat-toppens position mellem kontrolproduktet og det BAP-katalyserede reaktionsprodukt skyldes mindre pH-forskelle: tilsætning af fosfat-stamopløsning til assayet øgede højden af Pi-toppen, men producerede ikke ekstra toppe. Proton-koblede spektrer er helt i overensstemmelse med denne fortolkning (data ikke vist). (B) BAP-katalyseret Pt-oxidation producerer stoichiometriske mængder fosfat og molekylært H2. In vitro-reaktioner indeholdende de angivne komponenter blev inkuberet natten over ved 37°C i forseglede hætteglas. Headspace-atmosfæren blev derefter analyseret for H2 ved gaskromatografi med termisk ledningsevne-detektion, mens den vandige fase blev analyseret for fosfat ved hjælp af malachitgrønt-assay. Reaktioner (3 ml) blev udført i 50 mM Mops (pH 7,0) med 50 mM Pt (pH 7,0) og 387 μg renset BAP, som angivet. Der blev udført tredobbelt kontrol med enten BAP eller Pt alene, men hverken fosfat eller H2 blev detekteret under disse betingelser. In vivo-resultaterne viser mængden af H2 produceret under vækst af WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) i 0,4 % glukose/Mops-bouillon indeholdende 2,5 μmol af den angivne P-kilde. Da dette niveau af P (500 μM) er vækstbegrænsende, forventes P-kilden at være fuldstændig assimileret, når kulturerne når mætning. Efter vækst natten over ved 37 °C i forseglede beholdere blev hovedrummet analyseret for H2 ved gaskromatografi med termisk ledningsevne-detektion. Både in vitro- og in vivo-forsøgene blev udført aerobt (dvs. at der var O2 til stede under Pt-oxidationen).
Måling af H2 in vivo kompliceres af, at E. coli har flere hydrogenaser, der både kan producere og forbruge H2. For at omgå dette problem konstruerede vi en ΔhypABCDE-mutant, som ikke kan producere nogen aktive hydrogenaser, fordi den ikke er i stand til at modne forstadieproteinerne (32). Hyp-mutanten, dyrket aerobt i forseglede rør, producerede også omtrent stoikiometriske mængder H2 i kulturer dyrket med vækstbegrænsende niveauer af Pt, mens der ikke blev påvist H2 i kulturer dyrket med begrænsende niveauer af fosfat eller fosfatesteren fosfoserin (Fig. 2B ).
Pt-oxidation er ikke et fælles træk ved alle alkaliske fosfataser. Effektiv Pt-oxidation synes at være et unikt træk ved E. coli alkalisk fosfatase. Hverken Bacillus subtilis, som er kendt for at producere flere meget aktive fosfataser (33), eller P. stutzeri, som er kendt for at producere en fosfatase forskellig fra BAP (i stammer, der mangler Pt-dehydrogenasesystemet) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson og W.W.M., upublicerede data), kan bruge Pt som eneste P-kilde (Fig. 3A ), selv om begge organismer vokser på medier med phosphoserin som eneste P-kilde (data ikke vist). De fosfataser, der produceres af disse organismer, er således ikke i stand til at oxidere Pt med en hastighed, der er tilstrækkelig til at understøtte væksten. Vi testede også kommercielle præparater af kalvetarmfosfatase (CIP) og alkalisk rejefosfatase (SAP) for deres evne til at producere fosfat fra Pt (Fig. 3B ). Selv om der blev produceret små mængder fosfat af de eukaryotiske fosfataser efter inkubation natten over, var kun E. coli BAP i stand til at katalysere reaktionen med betydelige hastigheder. Dette resultat er særlig overraskende, fordi de eukaryote enzymer faktisk er langt bedre fosfataser med specifikke aktiviteter, der er op til 40 gange højere end BAP (27). Disse enzymer deler alle betydelig homologi (25-35% identitet) med E. coli BAP; desuden er de fleste af resterne på det aktive sted, herunder Ser-102 (som danner et kovalent fosfoenzym-intermediat under fosfatasereaktionen), bevaret (27).
Pt-oxidation er unik for E. coli alkalisk fosfatase. (A) B. subtilis’ og P. stutzeris’ evne til at oxidere Pt, som påvist ved vækst på medier med Pt som eneste P-kilde, blev testet, som beskrevet i fig. 1. Ingen af organismerne voksede på Pt-mediet, mens begge organismer voksede på fosfatmedium. På trods af at begge organismer har aktive fosfataser, kan ingen af dem altså oxidere Pt med en hastighed, der er tilstrækkelig stor til at understøtte væksten. P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) indeholder mutationer, der eliminerer de to karakteriserede Pt-oxidationsveje for denne organisme, men som ikke påvirker fosfataseekspressionen (9, 10). (B) BAP (alkalisk fosfatase fra E. coli), SAP (alkalisk fosfatase fra rejer; Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) og CIP (fosfatase fra kalvetarm; Sigma) blev analyseret for Pt-oxidation som beskrevet ovenfor. Der blev anvendt 56 μg af den angivne fosfatase i hvert forsøg, hvilket svarer til 3 BAP-, 32 SAP- og 65 CIP-fosfataseenheder, som målt ved pNPP-hydrolyse. På trods af de eukaryote enzymers meget højere fosfataseaktiviteter var det kun BAP, der katalyserede Pt-oxidation med betydelige hastigheder. Gennemsnittet af to forsøg er plottet.
Det forekommer plausibelt, at Pt-oxidation katalyseres af BAP ved en mekanisme svarende til den, der anvendes til fosfatesterhydrolyse (Fig. 4A ). Følgelig kan Pt hydrolyseres af BAP med hydridanion som den formelle afgangsgruppe. Til støtte for denne idé er en phoA-mutant, hvor Ser-102-resten på det aktive sted er ændret til alanin, ikke i stand til at bruge Pt som eneste P-kilde, hvilket indikerer, at denne aminosyre er nødvendig for fosfatesterhydrolyse (27) og for Pt-oxidation (Fig. 4B ). Selv om direkte hydridoverførsel fra et substrat til en vandig proton er biokemisk set uden fortilfælde, er denne reaktion termodynamisk rimelig i betragtning af det stærkt reducerende potentiale for fosfat-Pt-parret (E o′ = -0,650 V). Den H-producerende reaktion er således ganske gunstig: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (beregnet ud fra redoxpotentialer i ref. 34). Hvis den hydrolytiske model for Pt-oxidation viser sig at være korrekt, vil det være en meget usædvanlig enzymatisk reaktion. Undersøgelser har vist, at BAP også er i stand til at hydrolytere fosfodiestere (35), fosfoamider (36), sulfatestere (37) og thiophosphat (38). Disse reaktioner sker imidlertid med hastigheder, der er betydeligt langsommere end Pt-hydrolysereaktionen på trods af, at de involverer meget bedre afgangsgrupper. De er heller ikke redoxreaktioner. Den analoge reaktion, der involverer hydrolyse af alkylphosphonsyrer, katalyseres ikke af BAP, hvilket er vist både biokemisk (39) og ved Δphn-stammernes manglende evne til at anvende disse forbindelser som eneste P-kilder (13).
Pt-oxidation ved BAP kan ske ved hjælp af hydrolyse med hydrid-anion som afgangsgruppe. (A) Den kemiske mekanisme for phosphatesterhydrolyse ved BAP indebærer nukleofilt angreb af en aktiveret serinrest (Ser-102) på phosphatesteren for at danne et phosphoserinenzymintermediat. Den alkoxidafgående gruppe får hurtigt en proton fra opløsningen for at danne den tilsvarende alkohol. Det forekommer sandsynligt, at Pt-oxidation sker ved hjælp af en lignende mekanisme med hydridanion som afgangsgruppe. (B) Ser-102’s rolle i Pt-oxidation blev testet ved at undersøge, om en mutant, der bærer en Ser-102-Ala-mutation i phoA-genet, kunne vokse på Pt-medier, som beskrevet i fig. 1. Mutanten kunne ikke vokse på Pt-medium, hvilket viser, at det aktive sted Ser-102 er nødvendigt for Pt-oxidation. Værtsstammen var BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 og WM3611 bærer enkeltkopi-integranter af plasmiderne pKY1 og pKY2, som koder for henholdsvis wild-type phoA-genet (phoA+) eller phoA-S102A-mutanten (Ser-102-Ala).
Pt-dehydrogenase (PtxD) havde været det eneste in vitro-karakteriserede enzym, der havde vist sig at katalysere Pt-oxidation (11). Selv om detaljerne i BAP-reaktionen stadig mangler at blive opklaret, er de to enzymers kemiske mekanismer klart forskellige. Mens PtxD kræver NAD som elektronacceptor for redoxreaktionen, kræver den reaktion, der katalyseres af BAP, ingen eksogene elektronacceptorer, men udnytter den store termodynamiske drivkraft i reaktionen til at fremstille et stærkt reduceret produkt (H2) fra vand i en i det væsentlige irreversibel reaktion (beregnet K eq = 1,1 × 108). Alle andre kendte H2-producerende reaktioner fungerer meget tættere på kemisk ligevægt og er typisk reversible. Desuden indeholder alle andre kendte hydrogenaser enten Fe eller Ni, eller begge dele, i deres aktive steder (40). Denne observation omfatter den såkaldte “metalfrie” H2-dannende methylentetrahydromethanopterindehydrogenase fra methanogene archaea, som nu er kendt for også at indeholde Fe (41). I modsætning hertil indeholder BAP ingen redoxaktive metaller, selv om både Zn og Mg er nødvendige for hydrolytisk aktivitet (27). Behandling af BAP med chelatorer hæmmer Pt-oxidation, hvilket tyder på, at metaller spiller en rolle i Pt-reaktionen (data ikke vist).
Endeligt tyder de in vivo-data, der er præsenteret her, på, at Pt-oxidationsreaktionen er biologisk relevant. Observationen af, at mange bakterier besidder enzymer dedikeret til Pt-oxidation, viser, at denne egenskab er under stærkt selektivt pres i mikrobielle populationer (4, 5, 9, 42). Med dette faktum in mente er det interessant at bemærke, at selv om de eukaryote enzymer er langt bedre fosfataser, er de ude af stand til at foretage Pt-oxidation. Denne observation rejser den mulighed, at E. coli BAP måske ikke har udviklet sig til at være den mest effektive fosfatase, men snarere til at være en fosfatase med evnen til at hydrolytere Pt. Denne idé er i overensstemmelse med den besynderlige observation, at E. coli BAP udtrykkes meget kraftigt (op til 6 % af det samlede celleprotein) under fosfat-sultbetingelser (28). Den traditionelle forklaring på dette fænomen er, at et ukendt BAP-substrat må være dårligt hydrolyseret og derfor kræve store mængder enzym for at understøtte konkurrencedygtige vækstrater. Da der imidlertid kun er ringe forskel i de målte hydrolysehastigheder for en lang række fosfatester-substrater (39, 43), forekommer det usandsynligt, at dette dårlige substrat kunne være en fosfatester. I modsætning hertil er hastigheden af Pt-hydrolyse betydeligt lavere end hastigheden af fosfatesterhydrolyse, hvilket tyder på, at Pt kan være det substrat, der forklarer det ekstreme niveau af phoA-ekspression, der er observeret i fosfatfatfatfattig E. coli.
Det er klart, at mange detaljer i BAP-reaktionen med Pt stadig mangler at blive opklaret. Yderligere undersøgelser af denne unikke reaktion vil sandsynligvis ikke kun bidrage til vores forståelse af P redoxkemi og fosforyloverførselsreaktioner, men også til vores viden om hydridoverførsel, H2-producerende reaktioner og den rolle, som reducerede P-forbindelser spiller i naturen.