Invasionstest

Materialer:

Falcon 24 brønde vævskulturplade

Falcon cellekulturindsats:8μm porestørrelse, 24 brønde format

Cat# 3097

Matrigel (fortyndet iDMEM/F12)

5% Glutaraldehyd i 1XPBS

0.5% Toluidinblå i 2% Na2CO3

Forberedelse af Boydenkammer:

1. Med en steril tang fjernes cellevægsindsatserne fra deres emballage, og de lægges i brønde i en 24 brønde plade.
2. Vask indsatserne 2 gange med 300μl DMEM/F12

(Pas på ikke at stikke i membranen)

1. Føj 20μl 1:6 fortyndet Matrigel (2-3 mg/ml protein) til midten af hver cellebrøndindsats. Spred forsigtigt Matrigel over hele membranens overflade.
2. Sæt de belagte indsatser i inkubatoren for at lade Matrigel størkne i 20-30 min.

Forberedelse af celler til assay:

1. Behandle og dyrke celler i overensstemmelse med forsøgsbetingelserne. Det kan være ønskeligt at synkronisere cellerne til den samme væksttilstand.
2. Trypsinering og optælling af celler
3. Fjern trypsin og resuspender med frisk medium.
4. Placer 1X105 celler i 200 μl defineret medium i det øverste kammer.
5. Tilsæt 300 μl medium i det nederste kammer.
6. Dyrk i ca. 20 timer.

Tiden varierer for forskellige cellelinjer og kan være op til 48 timer for mindre invasive celler.

Fixering og farvning:

1. Efter dyrkning suges mediet fra det nederste kammer
2. tilsæt 0,5 ml 5 % glutaraldehyd i 1XPBS, inkubér i 10 minutter. @ R.T
3. Aspirér glutaraldehydopløsningen, vask hver brønd 3 gange med D.W
4. Tilsæt 0,5 ml 0,5 % toluidinblå farvelægningsopløsning i det nederste kammer, inkubér i 10-20 min @ R.T
5. Ansug opløsningen fra både det øverste og det nederste kammer, vask det nederste kammer 3 gange med D.W
6. Vis omhyggeligt den indre overflade af det øverste kammer af med en vatpind. (Pas på ikke at trykke for hårdt, da membranen kan springe ud.) Invaderede celler vil være i midten af bunden af membranen.
7. Tæl antallet af celler med q 20X-objektivet i mikroskopet. Der skal tælles mindst 3 felter pr. membran.