Patogenesen for denne lidelse er ikke fuldt ud opklaret, bortset fra det faktum, at det aflejrede keratin stammer fra keratinocytter . Der er blevet foreslået to patogene mekanismer, herunder apoptotisk (fibrillær) teori og sekretorisk teori . Ifølge den apoptotiske teori efterfølges degeneration af beskadigede keratinocytter i det basale lag af dermale histiocytter og fibroblaster, som omdanner disse kolloidlegemer til amyloid i den papillære dermis (figur 2). Ifølge den sekretoriske teori spredes aflejringer af amyloid, der stammer fra degenererede basale keratinocytter, til den papillære dermis gennem den beskadigede lamina densa . Der er flere ætiologiske faktorer involveret i patogenesen af makulær amyloidose: racefaktorer , genetisk prædisponering, miljøfaktorer , køn (kvinde) , kvindelige hormoner , udsættelse for sollys , friktion (langvarig slid) , atopi , autoimmunitet (baseret på association med systemisk lupus erythematosus, dermatomyositis, systemisk sklerose, sarkoidose og IgA nefropati) , og infektion med EBV . EBV, hvis tilstedeværelse er blevet rapporteret i epidermis ved makulær amyloidose, fungerer sandsynligvis som en faktor, der bidrager til degeneration af keratinocytter .

Rollen af EBV i etiopatogenese af primær kutan amyloidose er kun blevet evalueret i to tidligere undersøgelser, herunder en enkelt case report og en case serie på 27 patienter fra Kina . I betragtning af manglen på undersøgelser om forbindelsen mellem EBV og makulær amyloidose, satte vi os for at udføre en undersøgelse i denne henseende i Iran. Måske kan antivirale midler anvendes i fremtiden til behandling af denne sygdom i tilfælde af association med EBV.

2. Materialer og metoder

I denne case-kontrolundersøgelse blev 38 makulære amyloidoseprøver og 38 sunde hudprøver omkring udskårne melanocytære nevi fra alders- og kønsmatchede patienter uden makulær amyloidose indskrevet i den kliniske undersøgelse baseret på en ikke tilfældig objektivorienteret prøveudtagning. Inklusionskriterierne omfattede paraffinblokke med tilstrækkeligt væv i arkiverne på patologiafdelingen på Imam Reza Hospital i Mashhad, der var diagnosticeret med makulær amyloidose på grundlag af patologirapport og klinisk præsentation. Eksklusionskriterierne omfattede blokke med ufuldstændige data i arkiverne og utilstrækkelige prøver til PCR.

I case-gruppen blev amyloidaflejring bekræftet ved optisk mikroskopi og Congo red farvning. I det næste trin blev seks 5 μm sektioner fremstillet fra hver af blokkene i case- og kontrolgruppen under sterile forhold ved hjælp af steril kniv og blev anbragt i sterile Eppendorf-rør.

2.1. Deparaffinering

Xylol/ethanol blev anvendt til at deparaffinere de paraffinerede væv. En mL xylol blev tilsat mikrorør med vævsafsnit og inkuberet ved stuetemperatur i en halv time under konstant rystning. I det næste trin blev mikrorørene centrifugeret ved 13 000 rpm i 10 minutter, og supernatanten blev kasseret. Disse to trin blev gentaget én gang. Der blev tilsat 500 μL 100 % ethanol til udfældningen og centrifugeret i 10 m ved 13 000 rpm efter flere omvendinger af mikrorørene, hvorefter supernatanten blev fjernet. Dette trin blev gentaget igen. Endelig blev det resulterende bundfald anbragt ved stuetemperatur for at lade ethanolen fordampe fuldstændigt, men ikke bundfaldet.

2.2. DNA-ekstraktion

DNA-ekstraktion blev foretaget ved hjælp af BIO BASIC INC (Canada) kit med lotnummer 8401-140116. Der blev anvendt lysis buffer-T til ekstraktion. I næste trin blev der tilsat 100 μL ekstraktionsbuffer og 10 μL proteinase K til hvert mikrotube og blandet. Vævsprøverne blev tilsat til blandingen og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter blev prøverne inkuberet ved 95 °C i 3 minutter for at inaktivere proteinase K. 100 μL Universal Buffer NST blev tilsat til rørene og vendt 10 gange. Den opnåede blanding blev anvendt til PCR.

2.3. PCR

I denne undersøgelse blev PCR anvendt til at påvise tilstedeværelsen af EBV-genom i makulær amyloidose. Efter DNA-ekstraktion fra paraffiniserede blokke blev kvaliteten af det DNA, der var ekstraheret fra paraffinindlejret væv, bestemt ved hjælp af beta-globin-genprimere. GH20- og PC04-beta-globin-genprimerne, der blev anvendt i denne undersøgelse, forstærkede et fragment på 260 bp. Sekvensen af disse primere var som følger: GH20: 5′ GAA GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.De prøver, der producerede et fragment på 260 bp ved hjælp af de ønskede primere, blev anset for at være gunstige for amplifikation af EBV-virus BLLF1-genet.

Ekspredationen af EBV-sekvensen i de ekstraherede DNA-prøver blev testet ved hjælp af Cinna Gen-kit med parti nr. 935701 (Sina Clon, Iran). Dette kit er designet til at bestemme kvaliteten af EBV-DNA i inficerede prøver ved hjælp af PCR. Som reagens til blanding blev der anvendt optimeret 1x PCR som en blanding af rekombinant Taq DNA-polymerase, PCR-buffer, MgCl2, dNTP’er og primere. Den meget specifikke og repetitive region af BLLF1-genet, der koder for gp 350/220, amplificeres med primere. De kan påvise mindst 30 kopier af EBV. Tilstedeværelsen af 239 bp eller 256 bp fragmenter indikerer et positivt testresultat.

Dataanalysen blev udført ved hjælp af SPSS 11.5-software. Grafer og statistiske tabeller blev anvendt til at beskrive data, og Chi-square og uafhængige -tests blev anvendt til at sammenligne EBV i sunde og patienters prøver. I alle test blev signifikansniveauet 0,05 betragtet.

3. Resultater

Fifty procent af patienterne var mænd (19/38) og 50 % var kvinder (19/38). Tre patienter var i aldersgruppen under 20 år (7,9 %), 5 patienter 20-30 år (13,2 %), 10 patienter 30-40 år (26,3 %), 13 patienter 40-50 år (34,2 %), 4 patienter 50-60 år (10,5 %) og 3 patienter over 60 år (7,9 %). Minimums- og maksimumsalderen var henholdsvis 19 og 76 år. Der var 27 tilfælde af infektion i bagkroppen (71,1 %) og 11 tilfælde i ekstremiteterne (28,9 %). Undersøgelses- og kontrolgruppen var matchet med hensyn til alder () og køn ().

PCR blev udført for beta-globin-genet i 76 prøver (38 tilfælde og 38 kontroller), som var positiv i 61 prøver (30 prøver i tilfældegruppen og 31 i kontrolgruppen) og var negativ i 15 prøver (8 prøver i tilfældegruppen og 7 i kontrolgruppen) (Figur 3).

Figur 3

PCR-resultater af beta-globin-genet: Med hensyn til amplifikation er prøve 1, 2 og 3 en del af positivt beta-globin-gen (260 bp bånd), og prøve 4, 5 og 6 er negative. C+ og C- angiver henholdsvis positive og negative kontroller, og M repræsenterer DNA-markøren.

I 61 prøver, der var positive for beta-globin-genet i PCR, var BLLF1-genet fra EBV positivt i 23 tilfælde (8 tilfælde i undersøgelsesgruppen og 15 tilfælde i kontrolgruppen) og var negativt i 38 tilfælde (22 tilfælde i undersøgelsesgruppen og 16 tilfælde i kontrolgruppen) (figur 4).

Figur 4

PCR-resultater af BLLF1-genetet fra EBV: Prøverne 2, 4 og 5 er positive (239 bp eller 256 bp bånd) og prøverne 1 og 3 er negative. C+ og C- angiver henholdsvis positiv og negativ kontrol, og M repræsenterer DNA-markøren.

PCR af BLLF1-genet fra EBV var 26,7 % positiv i undersøgelsesgruppen og 48,4 % positiv i kontrolgruppen. Chi-square testresultater viste ingen korrelation mellem EBV og makulær amyloidose () (Tabel 1) (Tabel 1).

EBV DNA PCR Studiegrupper Chi-square testresultater Fælde Kontroller Antal Percent Antal Procent Positiv 8 8 26.7 15 48.4 Negativ 22 91.7 16 76.2 Total 30 31 61

Tabel 1

Procentvis fordeling af PCR-resultater fra EBV’s BLLF1-gen i 30 patienter med makulær amyloidose og 31 prøver af melanocytære nevus blandt prøver, der var positive for beta-globin-genet.

4. Diskussion

Amyloidose er kendt som ekstracellulær aflejring af eosinofilt hyalinmateriale af egen oprindelse med specifikke farvnings- og ultrastrukturelle karakteristika. Denne lidelse kan forekomme på baggrund af systemiske sygdomme eller kan være begrænset til huden. Makulær amyloidose er begrænset til huden . EBV kan stimulere keratinocytternes sekretion af amyloidmateriale eller kan være en stimulans for degeneration af keratinocytter og omdannelse af degenererede keratinocytfilamenter til amyloid . Nylige undersøgelser har vist, at epitelceller spiller en rolle i EBV’s fortsatte reproduktion. EBV-celleoverfladereceptorer, der findes i mindre differentieret pladeepithel, tyder på direkte infektion af epidermale keratinocytter. Infektion kan forekomme i germinative lag; virusreplikation er dog kun mulig gennem modning og differentiering af cellerne. Ekspressionen af cytokeratin i humane keratinocytter ændres in vitro efter infektion med EBV, hvilket resulterer i, at de omdannes til fibroblaster . Fibroblaster kan fagocytere keratinaggregater og omdanne dem til amyloid .

Drago et al. viste denne sammenhæng i Italien i 1996. Deres patient var en 30-årig kvinde med en tiårig historie med kløende brune papler og maculaer på brystet og ryggen med symptomer på kronisk træthedssyndrom. De kunne påvise EBV-genom i epidermale læsioner ved hjælp af in situ-hybridiseringsteknik. EBV-genomet blev hovedsageligt vist i basale epidermalceller såvel som i celler i højere lag, især i cytoplasmaet. Serologiske tests for EBV var også positive hos patienten. Antiviral behandling med acyclovir og interferon alfa forbedrede hudlæsionerne og de generelle symptomer hos patienten . En anden undersøgelse blev udført af Chang et al. på hudvæv fra 27 patienter med diagnosen lichen- og maculaamyloidose i Taiwan i 1997. In situ hybridiseringsmetoden indikerede EBV DNA i læsioner hos 11 patienter (40,7%), mens kontrolgruppen (herunder tre patienter med sekundær kutan amyloidose, to patienter med primær systemisk amyloidose og fire patienter med kronisk simplex lichen) manglede EBV DNA .

I henhold til denne undersøgelse var der ingen korrelation mellem EBV og makulær amyloidose (). EBV DNA var til stede hos 8 patienter med makulær amyloidose og 15 kontroller i vores undersøgelse. Forskellen i påvisningsgraden af EBV-DNA mellem patienter med makulær amyloidose og kontroller i denne undersøgelse og de nævnte undersøgelser kan skyldes følgende årsager:(1)Manglende sammenhæng mellem makulær amyloidose og EBV-infektion: Der er nogle få undersøgelser, der præsenterer utilstrækkelige beviser for en definitiv sammenhæng mellem EBV og makulær amyloidose, så på baggrund af resultaterne af vores undersøgelse kunne vi drage denne konklusion.(2)Metodologi (PCR versus in situ hybridisering): Vi anvendte en følsom metode til påvisning af EBV-DNA med positive og negative kontroller. Baseret på de tidligere undersøgelser er PCR lige så følsom som in situ hybridisering . Da vi imidlertid ikke anvendte in situ-hybridisering, kunne vi ikke lokalisere den nøjagtige inficerede celle med EBV i vores kontroller, som kan være de cirkulerende B-celler i huden i stedet for keratinocytter. Da vi brugte positive og negative kontroller i vores PCR-sæt til EBV, kunne de positive tilfælde i vores kontrolgruppe ikke være falsk positive. 3) Kontroller: Kontrollerne i vores undersøgelse var den sunde hud omkring melanocytære nevi, men kontrollerne i Chang-undersøgelsen var andre kutane lidelser. 4) Type af kutan amyloidose: I vores undersøgelse havde alle patienterne makulær amyloidose, men i begge de tidligere undersøgelser var de fleste af patienterne af lichen amyloidose.

5. Konklusion

I henhold til resultaterne af denne undersøgelse var der ingen korrelation mellem EBV og makulær amyloidose. Vi anbefaler brug af frisk væv eller hurtigt frosset biopsipunch samt samtidig serologisk undersøgelse af patienter for anti-EBV antistof for at opnå mere præcise resultater for sammenlignende undersøgelse af EBV DNA i makulær amyloidose. In situ PCR kan også anvendes til at lokalisere de EBV DNA-positive celler i prøverne. Andre gener kan anvendes til påvisning af EBV i vævet, da nogle EBV-prøver er muteret for BLLF1-genet, der anvendes i denne undersøgelse .

Det anbefales også at udføre en sammenlignende undersøgelse af påvisning af EBV i både involveret og uinvolveret hud hos patienter med makulær amyloidose.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Anerkendelser

Forfatterne udtrykker deres dybe taknemmelighed over for forskningsdeputeret for MUMS for økonomisk støtte og godkendelse af forskningsforslaget (nr. 911283) relateret til Narges Nazeris afhandling. Vi anerkender den økonomiske støtte fra Mashhad University of Medical Sciences.