Natriumazid inducerer mitokondriamedieret apoptose i PC12-celler gennem Pgc-1α-associeret signalvej

Introduktion

Natriumazid (NaN3) er et hvidt, farveløst og krystallinsk pulver og er klassificeret som et meget giftigt stof. Det har samme toksiske virkninger som cyanid, og det skader nervesystemet, hjerte-kar-systemet, øjnene og huden. Dette giftige stof bliver aktivt hurtigt efter indtagelse, og de vigtigste virkninger indtræder flere timer efter oral indtagelse, afhængigt af den indtagne mængde (1,2). Eksponering for NaN3 kan fremkalde en række symptomer inden for få minutter, herunder kvalme, opkastning, hovedpine, rastløshed, svimmelhed, svaghed, hurtig vejrtrækning og hurtig hjerterytme (3). Store mængder af dette giftige grundstof fremkalder straks kramper, tab af bevidsthed, lav puls og lavt blodtryk samt åndedrætsbesvær, hvilket i sidste ende fører til dødelighed (3). Blandt de påviste virkningsmekanismer for NaN3 er den mest relevante den cytokromc oxidase-respiratoriske kædekompleks-hæmning (4). Tidligere undersøgelser har vist, at NaN3, en inhibitor af kompleks IV (Cox IV), kan fremkalde apoptose i primære kortikale neuroner, som er caspase-3-afhængig og forbundet med frigivelse af cytochrom c (5).

I mitokondriel biosyntese kan promotoren af den respiratoriske kæde Cox IV aktiveres af nukleære respiratoriske faktorer (Nrf)-1/2. Samtidig kan Nrf justeres ved at regulere aktiviteten af gener, der koder for mitokondriel transkriptionsfaktor A (Tfam), for indirekte at regulere ekspressionsniveauet for respiratoriske kædegener. Nrf-1/2, Tfam, peroxisome proliferator-aktiveret-receptor γ co-aktivator 1-α (Pgc-1α) og andre co-aktivatorer udgør Pgc-1α-signalkaskaden, som spiller en central rolle i et reguleringsnetværk, der styrer den transkriptionelle kontrol afmitokondriel biogenese og respiratorisk funktion. I denne signalkaskade aktiverer Pgc-1α først Nrf-1/2 i modsætning til at binde sig direkte til mitokondrie-DNA’et, og Nrf-1/2 inducerer aktivering af Tfam i kombination med Tfam-promotoren og udløser transkription og replikation af mitokondrie-DNA, hvilket fører til øget ekspressionsniveau af mitokondrieproteiner(6). Samtidig kan Pgc-1α aktiveres af CaN-, Ca2+/calmodulin-afhængig proteinkinase (CaMK)-, mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK)- og cyklinafhængig kinase-medierede signalveje (7). I den foreliggende undersøgelse blev PC12-celler anvendt til at generere en dopaminneuronmodel, og virkningerne og mekanismen af NaN3 på de Pgc-1α-associerede signalveje i PC12-celler blev undersøgt for at identificere, om NaN3inducerede toksicitet i dyrkede PC12-celler og de underliggende mekanismer, der var involveret i disse virkninger.

Materialer og metoder

Materialer

Rat pheochromocytoma PC12-celler blev købt fra Cell Bank of Type Culture Collection of the Chinese Academy ofSciences (Shanghai, Kina). Stamopløsning af NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) blev opløst i steril saltvand for at fremstille en 1 M stamopløsning, som efterfølgende blev fortyndet til de ønskede koncentrationer før eksperimentet. Et et-trins TUNEL Apoptosis Assay kit (C1090), Annexin V-fluorescein isothiocyanat (FITC) Apoptosis Detection kit (C1063), Enhanced adenosin 5′-triphosphat (ATP) Assay kit (S0027), JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay kit (C2006) og Reactive Oxygen Species Assay kit (S0033) blev stillet til rådighed af Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kina).

Cellekultur og levedygtighedsassay

PC12-celler blev vedligeholdt i Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) suppleret med 10% føtal bovin serum (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) og 1% antibiotisk antimykotisk opløsning bestående af 10 000 U penicillin og 10 000 U streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37 °C i en fugtig atmosfære med 5 % CO2 og blev altid anvendt ved 70-80 % konfluens.

PC12-cellernes levedygtighed blev bestemt ved hjælp af et celletællingssæt (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Shanghai, Kina). Cellerne blev udsået i 96-well-plader med en tæthed på 1×105/well. Efter 24 timers dyrkning blev cellerne behandlet med NaN3 (0-80 mM) og inkuberet i 12, 24, 48 og 72 timer for at etablere en model for celleskader. Derefter blev 10 µlCCK-8-opløsning (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) tilsat til hver brønd og inkuberet i yderligere 2 timer under standardbetingelser (37 °C og 5 % CO2). Absorbansen ved en længde på 450 nm blev bestemt ved hjælp af ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). Celleviabiliteten blev beregnet i henhold til den gennemsnitlige optiske tæthed for 6 brønde. Eksperimenterne blev udført i tre eksemplarer. De passende koncentrationer af NaN3 til brug i efterfølgende eksperimenter blev bestemt i henhold til resultaterne af celleviabilitetsanalyserne.

Kernemorfologi af DAPI-farvedePC12-celler

PC12-celler blev udsat for 0, 10, 20 og 40 mMNaN3 i 24 timer. For at skelne mellem programmeret celledød og ikke-apoptotisk celledød blev kerner farvet med 10 µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Cellerne blev kort sagt vasket to gange med PBS og derefter fikseret med 4%paraformaldehyd ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter tre vaske blev de fikserede celler farvet med DAPI (1:5 000) i 5 minutter og derefter vasket med PBS. Fluorescensbilleder blev optaget med et Leica DMI fluorescensmikroskop (forstørrelse, ×400).

Måling af apoptosehastighed

Et Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kit (Beyotime Institute of Biotechnology) blev anvendt til at bestemme apoptose af celler i henhold til producentens instruktioner.Eksperimenter blev gentaget i tre eksemplarer og blev udført som følger: Apoptosehastigheden for kontrol-PC12-celler (0 mMNaN3) og PC12-celler, der blev eksponeret for 10, 20 og 40 mMNaN3 i 24 timer, blev målt ved flowcytometri (FC500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Statistiske analyser blev udført med SPSS statistisk software v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA).

Måling af mitokondriemembranpotentialet (ΔΨm)

ΔΨm er en vigtig parameter for mitokondriefunktion. Det blev vurderet ved hjælp af farvning med JC-1, en fluorescerende sonde. Eksperimenterne blev gentaget i tre eksemplarer og blev udført på følgende måde: Kontrol PC12-celler blev behandlet med 0 mMNaN3; og eksperimentelle PC12-celler blev udsat for 10, 20 og 40 mM NaN3 i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne i henhold til producentens protokol (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kina) inkuberet med mediet indeholdende JC-1 (1X) ved 37°C i 20 minutter, cellerne blev vasket tre gange med vaskebuffer og opsamlet med frisk medium uden serum. Samtidig blev den positive kontrol behandlet med carbonylcyanid3-chlorphenylhydrazon (CCCP), en inhibitor (10 µM), ved 37 °C i 20 minutter. Derefter blev den røde/grønne fluorescens bestemt ved hjælp af FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Forholdet mellem den røde fluorescensintensitet og den grønne fluorescensintensitet repræsenterede niveauerne af ΔΨm.

Måling af produktionen af reaktive oxygenarter (ROS)

ROS i PC12-celler blev vurderet ved hjælp af et ReactiveOxygen Species Assay-kit (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, Kina). Intracellulær ROS-generering blev vurderet ved hjælp af 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA), en fluorescerende sonde. Intracellulær ROS oxiderer DCFH-DA og giver den fluorescerende forbindelse 2′,7′-dichlorfluorescein (DCF), og DCFfluorescensintensiteten anses for at være parallel med mængden af dannet ROS i overensstemmelse med instruktionerne i ROS-analysesættet.Eksperimenterne blev gentaget i tre eksemplarer og udført som følger: Positiv kontrol blev behandlet med specifik koncentration af Rosup (50 mg/ml); kontrol-PC12-celler blev behandlet med 0 mMNaN3; og eksperimentelle PC12-celler blev udsat for 10, 20 og 40 mM NaN3 i 24 timer. Desuden blev PC12-cellerne behandlet med DCFH-DA (10 mM) opløst i serumfri DMEM (1:1 000) i 20 minutter ved 37 °C og derefter vasket tre gange med serumfri DMEM. Den positive kontrol blev behandlet med Rosup for at fremkalde ROSproduktion. ROS-produktionen blev bestemt ved hjælp af FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) repræsenterede niveauerne af ROS.

Måling af cellulært ATP-indhold iPC12-celler

Eksperimenterne blev gentaget i tre eksemplarer og udført som følger: Kontrol-PC12-celler blev behandlet med 0 mMNaN3; og eksperimentelle PC12-celler blev eksponeret forNaN3 i forskellige koncentrationer (10, 20 og 40 mM) i 24 timer. Derefter blev det cellulære ATP-indhold bestemt ved hjælp af etFirefly Luciferase ATP Assay-kit (Beyotime Institute ofBiotechnology) i overensstemmelse med producentens protokol.

Western Blot-analyse

PC12-celler blev udsat for 0, 10, 20 og 40 mMNaN3 i 24 timer, lyseret i radioimmunopræcipitationsassaylysebuffer (Beyotime Institute of Biotechnology) indeholdende aproteaseinhibitor og centrifugeret ved 13 362 × g i 10 minutter ved 4 °C for at opsamle supernatanterne. Efterfølgende blev proteinkoncentrationerne bestemt ved hjælp af BCA-kit (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Lige store mængder proteiner (90 µg) blev underkastet 10 og 12% SDS-PAGE og derefter overført til polyvinylidenfluoridmembraner (0,45 µm) ved hjælp af en Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Efter blokering med 5% bovin serumalbumin i TBS indeholdende 0.1% Tween-20 (TBST)i 2 timer ved stuetemperatur, blev membranerne inkuberet medprimære antistoffer mod Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1.000), Tfam (Abcam;1:1.000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc, Danvers, MA, USA, 1:500), pan-calcineurin A (CaN; Cell Signaling Technology Inc.; 1:1 000), phosphoryleret (p)-CaMKII(Cell Signaling Technology; 1:1 000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.; 1:1.000), p-extracellulær signalreguleret kinase (Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1.000), B-celllymphoma-2 (Bcl-2)-associeret X-protein (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) og cytochrom c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) ved 4°C natten over. Membranerne blev derefter vasket med TBST og inkuberet med heste-radish peroxidase (HRP)-konjugerede sekundære antistoffer (kanin; kat. nr. A0208;1:1.000; eller mus; kat. nr. A0216; 1;1,000; begge Beyotime Instituteof Biotechnology) i 1 time ved stuetemperatur. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af det forstærkede kemiluminescenssystem (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Kina) og analyseret kvantitativt med Image J version l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA), og β-actin blev valgt som belastningskontrol.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført med SPSSstatistical software v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Dataene er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse standardfejl af middelværdien. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupperne blev bestemt ved envejs variansanalyse efterfulgt af Bonferroni post-hoc-test. P<0,05 blev anset for at angive en statistisk signifikant forskel. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

Resultater

NaN3 hæmmer væksten af PC12-celler

Effekten af NaN3-eksponering på PC12-cellernes spredning blev vurderet ved CCK-8-assay. Cellerne blev udsat for forskellige koncentrationer (0-80 mM) af NaN3 i 12-72 timer. Tabel I og fig. 1A-D viser, at cellernes levedygtighed blev nedsat af NaN3 på en koncentrationsafhængig måde. Næsten 100 % af cellerne døde efter eksponering for 80 mM NaN3 i 72 timer, hvilket indikerer, at NaN3 i høj grad inducerede celledød, og at NaN3’s cytotoksicitet blev påvist på en dosis- og tidsafhængig måde. Eksponering for NaN3 i en koncentration på 20 mM i 24 timer forårsagede markant celledød i PC12-cellerne (50 %). Derfor blev de celler, der var dyrket i 24 timer, anvendt til efterfølgende eksperimenter.

Tabel I.

NaN3 undertrykker væksten af PC12-celler (n=6).

Cellemorfologi

Med DAPI-farvning blev de morfologiske ændringer af PC12-cellerne observeret ved fluorescensmikroskopi efter eksponering for forskellige koncentrationer af NaN3. Fragmenteringen af cellekerner, der blev udsat for NaN3 i 24 timer, blev observeret, og cellekernes skrumpning og kromatinkondensering blev øget en smule med koncentrationen af NaN3 i PC12-celler sammenlignet med kontrollen. I disse celler var de apoptotiske celler mindre og lysere sammenlignet med normale celler. Der blev også observeret kromatinkondensering og kernefragmentering, mens der blev identificeret blå kerner af levedygtige celler i kontrolgruppen.Desuden blev antallet af apoptotiske celler og intensiteten af grøn fluorescens forøget i celler udsat for NaN3 (Fig. 2).

Bestemmelse af apoptotisk hastighed ved annexin V-FITC-farvning

Døde celler eller sene apoptotiske celler, der har mistetcellemembranintegritet, kan farves med propidiumjodid. På grund af tabet af denne cellemembranintegritet kan Annexin V-FITC trænge ind i cytoplasmaet og kombinere sig med fosfatidylserin inde i cellemembranen og vise grøn fluorescens i døde celler.Fig. 3 viser, at antallet af apoptotiske celler var 5,03, 8,02, 43,77 og 78,67 % (P<0,05) i PC12-cellerne efter eksponering for NaN3 i forskellige koncentrationer (0, 10, 20 og 40 mM) i henholdsvis 24 timer. Disse resultater bekræftede desuden, at NaN3 inducerede celleapoptose i en dosisafhængig måde.

Ændringer i mitokondriemembranpotentialet (ΔΨm)

Mitokondrier anses generelt for at være vigtige reguleringsorganeller, der er involveret i cellens levedygtighed. Derfor blev ΔΨm anvendt som indikator for mitokondriefunktion. PC12-celler blev farvet med JC-1, et kationisk farvestof, der udviser potentialeafhængig ophobning i mitokondrier. Rød fluorescens (J-aggregater), der repræsenterer aktive mitokondrier med et stabilt membranpotentiale, blev observeret i et lille antal celler, der blev udsat for stigende koncentrationer af NaN3. Derimod blev der observeret grøn fluorescens (J-monomer), som repræsenterer apoptotiske mitokondrier med beskadiget ΔΨm, i et antal celler. Forholdet mellem rød og grøn fluorescens faldt gradvist i kontrolgruppen (fig. 4).

NaN3-induceret ophobning af mitokondrielle ROS

Det er velkendt, at mitokondrier er den primære kilde til cellulære ROS, og ROS spiller en vigtig rolle i forbindelse med aktivering af apoptotisk signalering. Derfor blev ROS’s rolle i NaN3-induceret PC12-celledød yderligere undersøgt. Fig. 5 viser, at fluorescensintensiteten i kontrolceller og celler, der var eksponeret for NaN3 i forskellige koncentrationer (0, 10, 20 og 40 mM) i 24 timer, var 3,65, 6,99, 18,63 og 39.35, hvilket indikerer, at NaN3-eksponering signifikant øgede produktionen af mitokondriel ROS sammenlignet med kontrolgruppen (P<0,05). Disse resultater antydede, at NaN3-induceret apoptose forbedrede produktionen af intracellulær ROS.

NaN3 nedregulerer den itokondrielle energiproduktion af cellulær ATP

For at evaluere ATP-indholdet i PC12-celler, der blev udsat for NaN3, blev den relative luminescensenhed (RLU) kvantitativt bestemt ved hjælp af et luminometer. Fig. 6 viser, at NaN3hæmmer den mitokondrielle ATP-produktion og gradvist nedsætter det cellulære ATP-niveau (P<0,05).

Ekspressionsniveauer af Pgc-1α og apoptose-associerede proteiner i PC12-celler

Pgc-1α-ekspressionen på proteinniveau blev signifikant nedsat efter NaN3-eksponering sammenlignet med kontrollen (P<0,05). Desuden er Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2, Nrf-2 og Cox IV velkendte downstream-mål for Pgc-1αdynamikken i forskellige celletyper (8). Den foreliggende undersøgelse identificerede, at NaN3-eksponering hæmmer Pgc-1α-dynamikken signifikant på en dosisafhængig måde (P<0,01; Fig. 7A).

Dertil kommer, at NaN3-eksponering opregulerede ekspressionsniveauerne af Bax og cytochrom c, mens den nedregulerede ekspressionsniveauerne af Bcl-2 og procaspase-3(P<0,05). Forholdet mellem Bax/Bcl-2 var også signifikant forøget i forhold til kontrolgruppen (P<0,05; Fig. 7B).

Proteinekspressionsniveauerne for andre vigtige medlemmer, herunder CaN, CaMKII, p-CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK og p-p38 MAPK, blev også vurderet. Resultaterne viste, at NaN3forøgede ekspressionen af CaN og fosforyleringen af CaMKII og p38 MAPK sammenlignet med kontrolgruppen, mens ekspressionsniveauerne af total CaMKII og p38 MAPK ikke blev ændret. Desuden var forholdet mellem p-CaMKII/CaMKII og p-p38/p38 MAPK i NaN3-gruppen signifikant forøget i forhold til kontrolgruppen (P<0,01; Fig. 7C).

Diskussion

For at bestemme, om NaN3 hæmmer PC12-cellernes spredning, blev antallet af behandlede celler i den logaritmiske fase sammenlignet med antallet af ikke-behandlede kontrolceller. Cellevæksten blev hæmmet med ~75% efter 24 timers eksponering for 20 mM NaN3. Derfor blev denne koncentration anvendt til de efterfølgende eksperimenter. Apoptose indebærer ændringer i den cellulære morfologi, herunder membranblødning, celleskrumpning, kromatinkondensering, kernefragmentering og DNA-fragmentering(9). For yderligere at analysere apoptosens kernemorfologi og apoptosehastigheden blev cellerne behandlet med 0, 10, 20 og 40 mM NaN3 i 24 timer. Efter behandlingen blev cellerne derefter farvet med DAPI og AnnexinV-FITC/PI, og kernes fordeling blev analyseret. Resultaterne bekræftede, at NaN3-eksponering inducerede apoptose i PC12-celler på en koncentrationsafhængig måde.

Mitokondrier er involveret i talrige metaboliske funktioner, herunder vedligeholdelse af intracellulær pH og produktion af ROS, som fremmer og regulerer celleapoptose (10). De kendetegn, der kendetegner celleapoptose, er forudgået af mitokondrieforandringer, herunder et tab af ΔΨm, et fald i energiproduktionen (ATP) og en stigning i mitokondriemembranens permeabilitet. Tidligere undersøgelser har antydet, atROS udløser skader på den mitokondrielle respiratoriske kæde og fremkalder tab af ΔΨm, som er de faktorer, der formidler eller forstærker den neuronale dysfunktion i løbet af den neurologiske degeneration og dermed fører til udvikling af neurologiske degenerative sygdomme (11,12).NaN3 er kendt for at fremkalde degeneration og excitotoksicitet ved at øge mitokondrialmembranens permeabilitetspotentiale gennem lipidperoxidation (13-15), og NaN3 udøver sin primære toksiske virkning ved at hæmme funktionen af cytokromoxidase i den mitokondrielle elektrontransportkæde og forhindre ATP-produktion (4). I den foreliggende undersøgelse blev FCM anvendt til at identificere ΔΨm og ROS-produktion i PC12-celler. Desuden blev ATP-syntesen i mitokondrier undersøgt efter eksponering for forskellige koncentrationer af NaN3. Den forstyrrelse af plasmamembranen, stigningen i mitokondriernes ROS-produktion og faldet i det observerede cellulære ATP-indhold tydede på, at NaN3-eksponering inducerede apoptose i PC12-celler.

Mitokondriel celledød kan aktiveres af mange forskellige stimuli, herunder udviklingsprogrammet, DNA-skader, endoplasmatisk retikulumstress, vækstfaktor- og næringsstofmangel, virusinfektion og oxidativ stress (16). Som medlem af den stadigt voksende familie af nukleare co-regulatorer kan Pgc-1α aktivere et stort sæt gener og regulere ekspressionsniveauet for gener, der er involveret i energimetabolisme som svar på signalveje, der medierer termogenese, glukoneogenese, skift af muskelfibertype ogmitokondriebiogenese (17).Disse co-regulatorer findes og fungerer i store multiproteinkomplekser, hvor de i stedet for at binde sig til DNA regulererNrf-1/2 og Tfam og modulerer deres transkriptionelle styrke ved at fremme de efterfølgende biokemiske interaktioner, der er nødvendige for induktion eller repression af gentranskription (8). Desuden kontrollerer Nrf-1/2 også indirekte ekspressionen af mitokondrie-DNA-kodede gener ved potent at inducere de kernekodede Tfam A, B1 og B2 (henholdsvis Tfam, Tfb1m og Tfb2m), som er regulatorer af mitokondriegenomets transkription og replikation (18). Tidligere undersøgelser har vist, at NaN3 er en inhibitor af mitokondrie-respiratorisk kædekompleks IV, som ofte er påvirket i primære mitokondrielle lidelser (19,20). i denne undersøgelse blev ekspressionen af Pgc-1α-signalkaskaden, herunder Pgc-1α-familieproteiner (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 og Tfam) og Cox IV, først undersøgt i PC12-celler for at verificere, om disse signalbegivenheder var involveret i NaN3-induceret apoptose. Resultaterne tydede på, at den NaN3-inducerede apoptose var forbundet med ekspressionsniveauet af Pgc-1α-familieproteiner og Cox IV i mitokondriermedieret signalvej. Når koncentrationerne af NaN3 blev øget, blev ekspressionsniveauet af disse proteiner signifikant nedsat, hvilket indikerer, at de kan være involveret i aktivering og udvikling af apoptose.

Omvendt kan kompleks IV udløse apoptose i primære kortikale neuroner, som er caspase3-afhængig og forbundet med frigivelse af cytochrom c (5). Det er velkendt, at mitokondrier er centrale regulatorer af celleapoptose. Proteinerne i Bcl-2-familien er de vigtige igangsættere af den mitokondrielle apoptosevej. Denne familie omfatter de pro-apoptotiske proteiner Bax, Bcl-2 homologousantagonist/killer og Bcl-2-associeret agonist af celledød samt de antiapoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-extra large (Bcl-xL). I sunde celler er Bax et inaktivt cytosolisk protein, men det flyttes over i mitokondrierne under apoptose. Det udøver sin pro-apoptotiske virkning ved at danne en pore i den mitokondriske ydermembran, hvorigennem cytokrom c frigives til cytoplasmaet, hvilket fører til aktivering af caspase 3 (21). De antiapoptotiske proteiner Bcl-2og Bcl-xL undertrykker Bax’ funktion ved at opretholde integriteten afmitokondriemembranen, hvilket forhindrer frigivelsen af cytokrom cand. i at aktivere caspase 3 (22). I den foreliggende undersøgelse øgede NaN3 niveauerne af pro-apoptotisk Bax ogcytochrom c og nedsatte niveauerne af anti-apoptotisk Bcl-2 ogprocaspase-3, hvilket indikerer, at NaN3 initieredemitochondrial apoptose-signalering i PC12-celler.

Dertil kommer, at ekspressionsniveauerne af Pgc-1αco-aktivatorer er stærkt inducerbare på transkriptionelt niveau via en række opstrøms signalveje. F.eks. induceres ekspressionen af Pgc-1α ved motion og kuldeeksponering under kontrol af stress-signalering via cellulær Ca2+ og cyklisk adenosin 5′-monofosfat (cAMP)-signalering (23). Transkriptionen af Pgc-1α kan påvirkes af CaMK, calcineurin, β-adrenerge receptor/cAMP og p38MAPK (24-26). Desuden har p38 MAPK, der tilhører MAPK-familien, en central funktion i celleproliferation, differentiering, transformation og apoptose, da aktivering af apoptose kan inducere Pgc-1α via direkte fosforylering (27). I den foreliggende undersøgelse blev ekspressionsniveauet for proteiner i Ca2+-signalveje (pan-calcineurin A og p-CaMKII/CaMKII) og p38 MAPK-vejen (p-p38MAPK/p38 MAPK og p-Erk1/2) undersøgt for at undersøge virkningerne af NaN3 på intracellulær Ca2+-homeostase og p38 MAPK. Dataene viste, at proteinniveauerne af pan-calcineurin A og p-CaMKII/CaMKII- og p-p38MAPK/p38 MAPK-forholdet steg, og at p-Erk1/2-niveauet faldt i den NaN3-behandlede gruppe, hvilket tyder på, at NaN3 udløste apoptose af PC12-celler på en dosisafhængig måde, og at en sådan aktivering var forbundet med Ca2+- og p38 MAPK-systemet. Samlet set bekræftede disse eksperimentelle resultater, at NaN3 kan fremkalde apoptose af PC12-celler ved at aktivere Ca2+- og p38 MAPK-baner. Så vidt vi ved, afslørede den foreliggende undersøgelse for første gang, at NaN3 induceredemitochondriamedieret apoptose i PC12-celler gennemPgc-1α-associerede signalveje, herunderCa2+/p-CaMKII og p38 MAPK.

Sammenfattende viste den foreliggende undersøgelse, atNaN3 kan inducere apoptose af PC12-celler. For at klarlægge den underliggende toksiske mekanisme ved NaN3-eksponering blev ekspressionsniveauerne for en række pro-apoptotiske proteiner (Bax og cytochrom c) og anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2, procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII og Pgc-1α) undersøgt. Resultaterne bekræftede, at pro-apoptotiske proteiner udøvede pro-apoptotiske virkninger på PC12-celler via aktivering og fosforylering af CaMKII og p38 MAPK, hvilket stimulerede aktiveringen af Pgc-1α og procaspase-3 i PC12-celler. Dataene danner grundlag for efterfølgende undersøgelser, der undersøger NaN3’s virkningsmekanismer på molekylært niveau. Fremtidige undersøgelser kan omfatte tilsætning af beskyttende midler, f.eks. mitokondriel divisionsinhibitor 1, et derivat af quinazolinon, som er en nyligt identificeretmitokondriel divisionsinhibitor, før NaN3-behandlingen, for at undersøge de neuroprotektive virkninger af det beskyttende middel med hensyn til at dæmpe NaN3-induceret apoptose i PC12-celler og for yderligere at belyse den underliggende mekanisme.

Acknowledgements

Ikke relevant.

Funding

Denne undersøgelse blev finansielt støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (grantno. 81571848) og Priority Academic Program Development ofJiangsu Higher Education Institutions.

Tilgængelighed af data og materialer

De datasæt, der er anvendt eller analyseret i denne undersøgelse, er tilgængelige hos den tilsvarende forfatter på rimelig anmodning.

Autors bidrag

YZ og SZ udtænkte og designede undersøgelsen. YZ, JH,HX, TG og YW indhentede dataene. YZ, JH og HX analyserede og fortolkede dataene og udarbejdede manuskriptet. Alle forfattere reviderede manuskriptet kritisk og læste og godkendte den endelige version af manuskriptet.

Ethisk godkendelse og samtykke til deltagelse

Uanvendeligt.

Patienters samtykke til offentliggørelse