Molekylær kloning er en række teknikker, der anvendes til at indsætte rekombinant DNA fra en prokaryotisk eller eukaryotisk kilde i et replikerende medium, f.eks. plasmider eller virale vektorer. Ved kloning forstås fremstilling af mange kopier af et DNA-fragment af interesse, f.eks. et gen. I denne video vil du lære om de forskellige trin i molekylær kloning, hvordan man opsætter proceduren og forskellige anvendelser af denne teknik.
Mindst to vigtige DNA-molekyler er nødvendige, før kloningen begynder. For det første og vigtigst af alt har du brug for det DNA-fragment, du skal klone, også kendt som insertet. Det kan komme fra en prokaryot, en eukaryot, en uddød organisme, eller det kan skabes kunstigt i laboratoriet. Ved at bruge molekylær kloning kan vi lære mere om funktionen af et bestemt gen.
For det andet har du brug for en vektor. En vektor er plasmid-DNA, der bruges som et redskab i molekylærbiologien til at lave flere kopier af eller producere et protein fra et bestemt gen. Plasmider er et eksempel på en vektor, og er cirkulært, ekstra kromosomalt, DNA, der replikeres af bakterier.
Et plasmid har typisk et multiple kloningssted eller MCS, dette område indeholder genkendelsessteder for forskellige restriktionsendonukleaser også kendt som restriktionsenzymer. Forskellige inserts kan inkorporeres i plasmidet ved en teknik, der kaldes ligation. Plasmidvektoren indeholder også en replikationsoprindelse, som gør det muligt at replikere den i bakterier. Desuden har plasmidet et antibiotikagen. Hvis bakterier inkorporerer plasmidet, vil det overleve i medier, der indeholder antibiotikaet. Dette gør det muligt at udvælge bakterier, der er blevet transformeret med succes.
Indsætningen og vektoren klones ind i en værtscelleorganisme, den mest almindelige, der anvendes ved molekylær kloning, er E. coli. E. coli vokser hurtigt, er almindeligt tilgængelig og har mange forskellige kloningsvektorer, der produceres kommercielt. Eukaryoter, som f.eks. gær, kan også anvendes som værtsorganismer for vektorer.
Det første trin i den generelle molekylære kloningsprocedure er at fremskaffe det ønskede insert, som kan stamme fra DNA eller mRNA fra en hvilken som helst celletype. Den optimale vektor og dens værtsorganisme vælges derefter på grundlag af typen af insert og det, der i sidste ende skal gøres med det. Der anvendes ofte en polymerasekædereaktion eller PCR-baseret metode til at replikere indsatsen.
Dernæst forbindes indsatsen og digestet ved hjælp af en række enzymatiske reaktioner og indføres i værtsorganismen med henblik på massereplikation. Replikerede vektorer oprenses fra bakterier og analyseres efter restriktionsfordøjelsen på en gel. Gel-purificerede fragmenter sendes senere til sekventering for at verificere, at indsatsen er det ønskede DNA-fragment.
Lad os se lidt mere detaljeret på, hvordan molekylær kloning foregår. Inden du begynder, skal du planlægge din kloningsstrategi, inden du foretager et kloningsforsøg på bænken. For eksempel vil enhver given plasmidvektor give dig et begrænset antal restriktionssteder til at inkorporere indsatsen via det multiple kloningssted. Du skal vælge restriktionssteder, der ikke findes i dit insert, så du ikke kløver det. Du kan komme til at stå i en situation, hvor du er tvunget til at sammenføje et fragment med en stump ende med et fragment, der har et overhæng. Hvis det er tilfældet, kan det være din eneste mulighed for at få insertet ind i den ønskede vektor ved at bruge klenow-fragmentet til at etablere en stump end-ligering. Det kan være en enorm tidsbesparelse at forstå de forskellige molekylære kloningsværktøjer, der står til din rådighed, samt at udarbejde en omhyggelig strategi, inden du begynder kloningen.
Den DNA-kilde, der skal anvendes til molekylær kloning, kan isoleres fra næsten alle typer celle- eller vævsprøver ved hjælp af enkle ekstraktionsteknikker. Når det er isoleret, kan der anvendes PCR til at amplificere indsatsen.
Når indsatsen er amplificeret, fordøjes både den og vektoren af restriktionsenzymer, også kendt som restriktionsendonukleaser.
Når den er fordøjet, kan indsatsen og vektoren køres på en gel og oprenses ved en proces, der kaldes gelrensning. Med hensyn til vektoren vil dette trin hjælpe med at rense lineariseret plasmid fra uskåret plasmid, der har tendens til at fremstå som en smøre med høj molekylvægt på en gel.
Efter gelrensning af digesterne ligeres eller forbindes insertet med plasmidet via et enzym, der kaldes DNA-ligase.
Generelt set er det altid en god idé at opstille ligationer, så forholdet mellem insert og vektor er 3 til 1, hvilket sikrer, at kun en lille mængde af vektoren vil selvligere. Når ligationen er opstillet på is, inkuberes den et sted mellem 14-25˚C fra 1 time til natten.
Dernæst udføres transformation for at indføre plasmidvektoren i den vært, der vil replikere den.
Efter transformationen udplottes bakterier på agarplader med antibiotika og inkuberes natten over ved 37°C. Da plasimidet indeholder et antibiotikaresistensgen, vil en vellykket transformation give bakteriekolonier, når det dyrkes på agarplader i tilstedeværelse af antibiotika. De enkelte kolonier kan derefter plukkes fra den transformerede plade, anbringes i flydende vækstmedier i nummererede rør og anbringes i en rystende inkubator til ekspansion. En lille mængde af den flydende kultur tilsættes til en nummereret agarplade, mens resten af kulturen går videre til plasmidrensning. Nummereringsskemaet, der angiver identiteten af de bakteriekolonier, hvorfra plasmiderne i sidste ende skal oprenses, bevares under hele plasmidoprensningsprocessen.
En prøve af det rensede plasmid skæres derefter med restriktionsenzymer. Digesten indlæses og køres derefter på gel for at kontrollere for tilstedeværelsen af insert, hvilket vil bekræfte, at bakteriekolonien er blevet transformeret med et plasmid, der indeholder et insert, og ikke et selv-ligeret plasmid. Bakterier, for hvilke det er bekræftet, at de er blevet transformeret med et plasmid indeholdende et insert, ekspanderes med henblik på yderligere plasmidrensning. Sekventering anvendes som et sidste kontroltrin for at bekræfte, at det ønskede gen er blevet klonet.
Molekylær kloning kan anvendes til et næsten ubegrænset antal anvendelser. Når f.eks. en mRNA-skabelon omvendt transskriberes til cDNA, eller komplementært DNA, af et enzym kaldet omvendt transkriptase, og der derefter anvendes PCR til at amplificere cDNA’et, kan molekylær kloning anvendes til at skabe et cDNA-bibliotek – et bibliotek med alle de gener, der udtrykkes af en given celletype.
Molekylær kloning kan også anvendes til at tage en række gener eller en genklynge fra en bakteriestamme, reorganisere dem til plasmider, der transformeres i en anden stamme, således at en hel biosyntetisk vej kan genskabes for at producere et komplekst molekyle.
Gennem molekylær kloning kan et mutantbibliotek genereres ved at udtrykke et målplasmid i en særlig bakteriestamme, der bruger en fejlbehæftet polymerase, når den dyrkes ved bestemte temperaturer. Mutationerne kan karakteriseres ved sekventering. Bakterier, der er transformeret med mutantgener, kan derefter testes med forskellige lægemidler eller kemikalier for at se, hvilke bakteriekolonier der har udviklet sig til at have lægemiddelresistens.
Takket være molekylær kloning kan reportergener inkorporeres i DNA-plasmider, et almindeligt reportergen er grønt fluorescerende protein eller GFP, som udsender en grøn fluorescens, når det udsættes for UV-lys. Et reportergen kan også indsættes i et alfavirus for at vise infektion i myg og overførbarhed i celler.
Du har lige set JoVEs video om molekylær kloning. Du burde nu forstå, hvordan molekylær kloning fungerer, og hvordan teknikken kan bruges i molekylærbiologien. Som altid tak fordi du så med!