Forskningsundersøgelser

I vores undersøgelser har vi undersøgt én EU-afgrøde, Pisum sativum (ærter). Ærter er modtagelige for en lang række vira, herunder ærte enation mosaik virus, ærte tidlig brunfarvning virus og en række vira fra Potato virus Y-gruppen (Potyviridae). Inden for sidstnævnte gruppe er bønne gul mosaikvirus, bønne almindelig mosaikvirus, ærte mosaikvirus og ærtefrøbåren mosaikvirus (PSbMV) alle vigtige patogener. Vi har især undersøgt PSbMV, som alle kommercielle sorter af ærter er modtagelige for. Denne modtagelighed forværres af, at denne virus ikke blot overføres fra plante til plante af dens bladlusvektor, men også overføres vertikalt fra generation til generation i frøene. Denne egenskab har resulteret i alvorlig forurening af samlinger af ærternes kimplaser og er et meget effektivt middel til at give en tidlig og udbredt infektion af afgrøderne kort efter frøspiringen. Hvis man tænker på, at en frøoverførselseffektivitet på kun 0,1 % ville resultere i 10 000 infektioner efter såning af frø med 107 frø pr. hektar, så bliver betydningen af frøoverførsel tydelig. På nuværende tidspunkt imødegås dette problem ved effektiv testning af frøprøver efter høst ved hjælp af immundetektion af viruscoatproteinet og ved at afvise kontaminerede frøpartier. Som et alternativ, og da frøtransmissionen i en række ærtesorter varierer fra 0 til 100 %, har vi undersøgt, om man kan opdrætte resistens mod frøtransmission i forbedrede ærtelinjer. I testkrydsninger og tilbagekrydsninger mellem linjer med ingen transmission eller 60-80 % transmission opførte resistens sig som en dominerende karakter, selv om den i F2- og BC2-generationerne ikke blev segregeret som en Mendelsk egenskab. Den kvantitative karakter af fænotypen tydede på, at frøtransmission ville være vanskelig at inkludere som en resistensegenskab i et konventionelt avlsprogram.

Naturlig resistens over for PSbMV er blevet identificeret i ærteaccessioner fra Nordafrika og Asien, selv om disse recessive gener indtil videre ikke er blevet indarbejdet i kommercielle linjer. Genetisk analyse har vist, at disse gener er grupperet sammen med andre recessive gener med forskellige potyvirusspecificiteter på to steder i ærtegenomet. Generne sbm-1, sbm-3 og sbm-4, der giver resistens over for henholdsvis PSbMV-patotyperne PI, L-l og P4, er placeret på kromosom 6, mens sbm-2, der også giver resistens over for patotype L-l, er placeret på kromosom 2 . Selv om denne organisering tyder på lokal genkonvertering og translokation mellem kromosom 2 og 6, tyder andre beviser på, at de to genklumper kan have forskellig oprindelse og funktion. Ved hjælp af rekombinante hybridvirus fremstillet mellem forskellige patotyper er virusets avirulensdeterminant blevet defineret som det genomelinkede virusprotein (VPg) for sbm-1 . En strukturel og funktionel analyse af sbm-1-genet er emnet for et EF-bioteknologiprojekt nr. BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) med deltagelse af forskningsgrupper og industrien fra Danmark, Finland, Spanien og Det Forenede Kongerige.

Karakteriseringen af sbm-1-genet vil give særlige intellektuelle og praktiske fordele. Da ca. 20 % af alle virusresistensgener og ca. 40 % af de gener, der giver resistens over for potyvirus, er recessive, vil det være vigtigt at forstå, hvordan sbm-1 fungerer, og hvad der styrer specificiteten af de tilstødende sbm- og andre potyvirusresistensgener, når det gælder en lang række sygdomme. sbm-projektet har imidlertid også tekniske udfordringer, ikke mindst fordi det skal håndtere størrelsen og redundansen i ærte-genomet. Ærte-genomet er ca. 5 x 109 basepar pr. haploid genom, hvilket er ca. 50 gange større end genomet fra Arabidopsis thaliana. Det er ikke lykkedes at foretage kortbaseret kloning af gener i ærter, og der findes endnu ikke store indsætningsbiblioteker. Der er imidlertid et potentiale i sbm-1 til at identificere en ny klasse af resistensgener. Resistensgener, der hidtil er klonet fra andre arter, falder ind i to klasser. De dominerende resistensgener, der fungerer mod specifikke vira, svampe og bakterier, falder generelt ind under “NBS-LRR”-klassen og formidler en overfølsom resistens over for infektion. Det eneste recessive gen, der er blevet klonet (mlo), formidler en ikke-racespecifik resistens over for meldug i byg og er også forbundet med lokalisering af patogenet i døde celler. Funktionelt fungerer Mlo som en negativ regulator af konstitutiv resistens . I modsætning hertil er sbm-1 racemæssigt (eller patotypemæssigt) specifik og er ikke forbundet med celledød. Ud fra disse sammenligninger synes flere funktionelle mekanismer for sbm-1 at være mulige. For det første kan vi betragte Sbm-1 som en dominerende modtagelighedsfaktor, der er nødvendig for at hjælpe virusreplikation. Dette ville passe med den sandsynlige involvering af VPg i viral RNA-replikation og observationen af, at protoplaster fra resistente planter ikke viser nogen påviselig virusreplikation . For det andet kunne Sbm-1 ligesom Mlo fungere som en negativ regulator af resistens, selv om forskellene i specificitet i forhold til mlo ville placere sbm-1 i en særskilt klasse af resistensgener. For det tredje kunne sbm-1 være en dominerende, men dosisafhængig svag resistensallel. Vi foretrækker den første mulighed som den mest direkte og enkle fortolkning.

For vores komponent i EF-bioteknologiprojektet har vi valgt at anvende genetiske metoder til at identificere sbm-1-resistensgenproduktet. Efter at have identificeret egnede ærtelinjer (et BC4-par af linjer, der bærer homozygote resistens- og modtagelighedsalleler) er der anvendt en cDNA-AFLP-strategi til at identificere udtrykte gener, der stammer fra den introgresserede region. Indtil videre er der blevet identificeret ti polymorfe cDNA’er. Disse er ved at blive kortlagt ved hjælp af rekombinante indavlsfamilier for at bekræfte deres genomiske oprindelse. Vores alternative strategi er at “fiske” efter sbm-1-genproduktet ved hjælp af gær-to-hybrid-systemet med PSbMV VPg som lokkemadprotein. To stærke kandidat-cDNA’er og otte andre cDNA’er, der koder for interaktorproteiner, er blevet identificeret fra et cDNA-bibliotek af ærter, der er fremstillet fra en modtagelig ærtelinie. Disse cDNA’er er også ved at blive sekventeret og kortlagt.

Som led i et tidligere EC-AIR-projekt (# CT94-1171), der involverer akademiske og industrielle partnere i Danmark, Frankrig og Det Forenede Kongerige, har vi også undersøgt potentialet for udvikling af PDR mod PSbMV i transgene ærter. Da man i andre systemer almindeligvis har anvendt det virale replicase-gen til at give PDR ved at udløse processen med post-transkriptionel gensilens (PTGS), har vi anvendt PSbMV-replicase-cistronen (NIb) til transgene ekspression i ærter . Af 35 ærtelinjer, der er transformeret med Agrobacterium tumefaciens T-DNA med en 35S promotor -Nib – 35S terminatorkonstruktion og bar-genet som selekterbar markør for transformeret væv i tilstedeværelse af herbicidet Bialophos, viste tre linjer sig at være resistente over for PSbMV. To af disse linjer havde en direkte gentagelse af 3′-enden af Nib-genet (NIbIb), da der var tegn på, at komplekse transgenarrangementer havde større potentiale til at igangsætte PTGS. Alle disse linjer udviste en form for PDR, der kaldes “recovery”, hvor en udfordringsinokulation resulterer i en indledende infektion, men hvor planterne hurtigt kommer sig og ikke viser flere symptomer eller virusakkumulering. De genoprettede væv er derefter resistente over for yderligere angreb med de homologe eller nært beslægtede virusisolater. For at vurdere betydningen af dette i marken, hvor planterne kan blive udfordret med en population af beslægtede virus, blev det vurderet, om forskellige PSbMV-isolater er i stand til at udløse PTGS og blive målrettet af induceret PTGS. Dette viste, at virus med ca. 89 % eller mere identitet i NIb-cistronen kunne fremkalde resistens, selv om kravene til specificitet for, at et andet virus, som skal betragtes som et mål, kan være højere. Til reference kan det nævnes, at de to mest divergerende sekventerede PSbMV-isolater adskiller sig med 89 % i Nib-regionen. Denne forskel i specificitetskravene til udløsning og målretning i PTGS vil være en vigtig overvejelse i forbindelse med anvendelsen af teknologien på kommercielle afgrøder. Den relativt brede resistens over for PSbMV-isolater i Nib-transgene ærter står i kontrast til den ekstreme patotypespecificitet, der ses for de naturlige sbm-resistensgener, hvor kun en eller få ændringer i virusets avirulensdeterminant er nok til at ændre et PSbMV-isolat fra avirulent til virulent .

På trods af den korte periode for den indledende infektion viste de transgene ærteplanter god vækst og frøsætning efter udfordringsinokulation og gav udbytter under drivhusforhold svarende til dem, der blev set for uinficerede transgene eller ikke-transgene linjer. Vi mener, at med forbehold af licensaftaler, der dækker brugen af bar-genet til udvælgelse af transformerede planter, kunne disse planter være nyttige tilføjelser til panelet af patogenresistensgener, der skal anvendes til udvikling af nye forbedrede ærtelinjer.

De transgene ærteplanter repræsenterer de første bælgplanter, der viser PDR mod potyvirusser, og nogle af de første eksperimentelle eksempler i Leguminosae på planter, der viser PTGS. Det var derfor værdifuldt at fastslå, at de principper, der styrer PTGS og resistens i dette system, understøttede dem, der er karakteriseret ved mere almindeligt anvendte forsøgsplanter (f.eks. Nicotiana spp.). Som forventet for PTGS var den inducerede virusresistens forbundet med nedbrydning af transgen-RNA og PSbMV-RNA . Vi viste også, at PTGS blev formidlet i disse planter af et systemisk signal, der blev genereret i den indledende fase af virusinfektion, og at dette signal havde potentiale til at formidle spredningen af PTGS ved at inducere methylering i den transskriberede region af NIb-transgenet .

Sammenfattende har vi erkendt, at landbrugsindustrien ville have gavn af at have stabil og effektiv resistens mod PSbMV i ærter. Den mindst kontroversielle vej til at opnå dette ville være gennem inkorporering af naturligt forekommende resistens (enten mod frøoverførsel eller mod virusreplikation) ved hjælp af konventionelle avlsstrategier. Vores forholdsvis ringe forståelse af den genetiske kompleksitet af PSbMV-frøtransmission betyder, at dette sandsynligvis ikke vil være nyttigt på kort sigt. sbm- generne er mere lovende, selv om manglen på tæt forbundne genetiske markører og resistensens recessive karakter skaber visse vanskeligheder. Alternativt har vi påvist potentialet for at skabe resistens ved hjælp af transgene teknologi, selv om spørgsmålene om biosikkerhed og offentlighedens accept skal løses. Ud over disse anvendte overvejelser har forskningen genereret og genererer stadig materialer og viden, som vil få indflydelse på, hvordan beslægtede metoder kan anvendes i andre afgrødeplanter. Især vil det være vigtigt at forstå virkningsmekanismerne for en ny klasse af virusresistensgener.