Indledning

En del af det sollys, der når jorden, omfatter det ultraviolette spektrum, der består af tre sektioner: UVC (200-290nm), UVB (290-320nm) og UVA (320-400nm). UVC absorberes fuldstændigt af jordens atmosfære. Den mængde UVA, der når jorden, er mere end 20 gange så stor som UVB.1 UVA spiller en vigtig rolle i forbindelse med for tidlig aldring og fotokarcinogenese. UVA øger frigivelsen af inflammationsfaktorer, herunder IL10 fra keratinocytceller. Desuden øger det ekspressionen af inflammatoriske proteiner som TNFα, IL1α, IL6 og IL8.2,3 UVA spiller en betydelig rolle i skabelsen af mutationer i mitokondrie-DNA i den menneskelige hud ved hjælp af ROS (reaktive iltspidser). Det forårsager også for tidlig hudaldring ved at skabe en mutation i fibroblastceller i den menneskelige hud.4 Den rolle, som øget ekspression af p53-proteinet spiller ved at forårsage UVA-induceret apoptose, er ubestridelig.5 8-hydroxy-2′-deoxyguanin (8-oxoG) er en værdifuld indikator til at spore den oxidative DNA-skade forårsaget af UVA, og det kan føre til G → T-transversioner.6

Der er derfor meget vigtigt at beskytte mod UVA sammen med UVB.

UVA-beskyttelsesfaktoren (UVA-PF) bruges til at vurdere solbeskyttelsesprodukters effektivitet mod UVA-stråler.

Materialer og metoder

I denne undersøgelse blev globale standarder inden for bestemmelse af UVA-PF gennemgået og sammenlignet. Fire standarder, nemlig ISO 24443 (stillet til rådighed af Den Europæiske Union i maj 2013), CEN2006 (stillet til rådighed af Den Europæiske Union, Sydafrika og Japan i Bruxelles den 12. juli 2006), FDA 2007 (stillet til rådighed af USA den 27. august 2007) og FDA 2011 (stillet til rådighed af USA den 17. juni 2011), har opstillet forskellige protokoller inden for UVA-beskyttelsesfaktor. Nogle er behandlet ved hjælp af in vivo-metoder, mens andre er behandlet ved hjælp af in vitro-metoder.7-11

Resultater

På grund af UVA’s rolle i forekomsten af hudskader er det vigtigt at anvende solcremer, der beskytter huden mod både UVA og UVB. In vitro-metoder til måling af UVA-PF er ikke pålidelige og reproducerbare på grund af forskelle i testbetingelserne, f.eks. forskel på substrater, variant af mængden af påført produkt og UV-dosis af bestråling12 . Blandt FDA 2007- og CEN-standarderne, der introducerer in vivo PPD-tilgangen, har begge fordele og ulemper, så anvendelse af en bedre tilgang i hvert enkelt tilfælde kan give bedre resultater.

Diskussion

In vivo UVA-PF-bestemmelsestestestvurdering

Først vil vi gennemgå in vivo UVA-PF-bestemmelsesmetoder udført ved hjælp af øjeblikkelig pigmentformørkelse (Immediate Pigment Darkening (IPD), vedvarende pigmentformørkelse (PPD) og beskyttelsesfaktor A (PFA). I CEN- og FDA-standarderne fra 2007 accepteres PPD-metoden imidlertid kun i forbindelse med in vivo-metoden til bestemmelse af UVA-PF (tabel 1).

Tabel 1 Sammenligning af protokoller til in vivo UVA-PF-bestemmelse

I PPD-metoden udvælges personer, der opfylder kriterierne for testen, ligesom SPF-målemetoden (solbeskyttelsesfaktor), med et bestemt antal til deltagelse. I SPF-testen er slutpunktet et erythemisk respons i modsætning til PPD-testen, hvor slutpunktet er vedvarende pigmentmørkfarvning af testunderstederne. Teststeder og -understeder udformes i specifikke dimensioner blindt på deltagernes kroppe. Test- og reference solbeskyttelsesprodukterne vejes i den definerede mængde og påføres på deltagerens hud. Derefter spredes produktet efter en bestemt metode over huden efterfulgt af en ventetid, hvor produktet tørrer. Personer udsættes på en forudbestemt måde for UVA-stråling i siddende eller liggende stilling på maven. Efter et vist tidsrum fra den sidste UV-eksponering vurderes niveauet af pigmentets permanente mørke som testens slutpunkt, og UVA-PF beregnes ved hjælp af et sæt formler (som vil blive diskuteret i afsnittet “Statistik og beregninger” ).

Udvælgelseskriterier for deltagere

På trods af de kriterier, der er nævnt i tabel 1 (FDA 2007 og CEN’s fælles kriterier), har CEN-standarderne yderligere deres forholdsregler for deltagelse i testen.

Kriterierne for en sund mand og kvinde, der kan komme i betragtning, omfatter:

• Hudtype II, III og IV13
• Ingen soltest inden for de sidste to måneder (ingen resterende mærker på ryggen).
• Ingen soleksponering på rygområdet i mindst 2 måneder før undersøgelsen.
• Frihed af ar eller aktive dermale læsioner på de områder af ryggen, der er testet.
• Testområdet skal være ensartet i farven, uden nevi, pletter eller solar lentigo uden overdreven behåring.

CEN har også fastsat en række udelukkelseskriterier for testen;

• Personer, der ikke opfylder de tidligere inklusionskriterier.
• Graviditet eller ammende kvinder,
• Historie med allergi, fotoallergi, fototoksiske eller andre unormale reaktioner på sollys eller følsomhed over for kosmetiske produkter, toiletartikler, solcreme, latex og/eller topiske lægemidler.
• Personer med dermatologiske problemer på testområdet.
• Personer, der har brugt selvbrunerprodukter på ryggen i den foregående måned.

Som følge heraf synes CEN at være mere egnet til personer, der vælger kriterium på grund af større konsistens.

Antal deltagere

I FDA 2007 og CEN anvendes henholdsvis 20 til 25 personer og 10 til 20 personer. Ligesom andre kliniske undersøgelser medfører et højere antal deltagere en højere testnøjagtighed, jo højere deltagerantallet er. På den anden side fører den store stikprøvestørrelse til nogle problemer såsom håndtering af protokollen, tilvejebringelse af tilstrækkelige prøver og frivilliges frafald.

Reference solcremeformuleringer

Det anbefales, at der anvendes en standardprøve til at verificere resultaterne af hver testprøve.

Testen er gyldig, hvis den gennemsnitlige UVA-PF, der opnås for reference solcremeproduktet, ligger inden for det angivne interval. Ifølge tabel 1 er begge referencesolcremer gode valg, da deres UVA-PF-resultater ligger tæt på hinanden, og deres aktive ingredienser er godkendt.

Størrelse af teststeder og delsteder

Det, der er vigtigt ved valg af størrelsen af stederne og delstederne, er muligheden for at anvende multi-source solsimulator. Det betyder, at hvis man vælger mindre størrelser på stederne og understederne, kan det resultere i, at flere understeder udsættes for UV-stråling på samme tid. Derfor er CEN-standardfunktionerne (for lokalitetsstørrelser på 30 cm2 og for underlokalitetscirkler med en diameter på 8 mm) mere hensigtsmæssige på dette område.

For afstandene mellem de to underlokaliteter foreslår FDA 2007 et interval på 1 cm. CEN angiver ikke noget interval mellem subsites, hvilket gør FDA 2007-funktionen betydelig for subsites-afstande.

Ladningsdosismængde

Ladningsmængden for test- og referenceproduktet bestemmes i næsten samme mængde. CEN foreslår intervallet 2mg/cm2±2,5%, og FDA 2007 foreslår 2mg/cm2, som skal belastes ensartet og spredes med en fingerseng. Produktet bør anbringes i små dråber i hele testområdet og spredes med særlige bevægelser.

Spredetiden bør tage 20 til 50 s. Produktbelastningsområderne bør vælges tilfældigt.

Ventertid mellem påføring af solcreme og UV-eksponering

Ventertiden mellem påføring af produktet og UV-eksponering foreslås af henholdsvis FDA 2007 og CEN til mindst 15 min og 15 til 30 min.

Stråleudstyr og periodisk inspektion af dets lampe

Tabel 1 indeholder en liste over specifikationerne for stråleudstyret for hver af de to standarder. Med hensyn til den periodiske inspektion af anordningen foreslår FDA 2007 og CEN-standarden, at inspektionen udføres henholdsvis hver 6. og 12. måned.

I henhold til FDA 2011 er kalibreringsdata for solcellesimulatorer og deres UV-lamper stabile i perioder længere end 1 år; Det er således bedre at overveje den periodiske vurdering af anordningen en gang om året.

Eksponeringstendens

Som det fremgår af eksponeringstendensen i tabel 1, er konceptet for begge metoder det samme.

Tidspunkt og tilstand for MPD-vurdering

MPD er den mindste mængde UVA-stråling, der producerer synlig håndgribelig pigmentering med synlige grænser. Når pigmentmørket er fastsat, vurderes MPD visuelt. Til MPD-evaluering foreslår CEN og FDA 2007 henholdsvis 2 til 4 timer og 3 til 24 timer efter den sidste eksponering på stedet. Den visuelle vurdering bør foretages i blinde af en erfaren observatør under passende og ensartede lysforhold. FDA bemærker, at pigmentformørkelsen tilsyneladende er mest stabil omkring 3 timer eller mere efter bestråling, og foreslår derfor, at denne observation finder sted 3 til 24 timer efter bestråling. Dette tidsinterval giver større fleksibilitet i testmetoden uden at gå på kompromis med nøjagtigheden. Derfor synes FDA 2007-kriterierne at være bedre.

In vitro UVA-PF-bestemmelsestestest Vurdering

Alle in vitro-metoder er baseret på evaluering af UV, der passerer gennem et tyndt lag solcreme, der spredes over en ru plade, således at UV-niveauet beregnes før og efter eksponering for den kontrollerede dosis fra strålekilden. I forbindelse med beregningen af UVA-beskyttelsesniveauet fastsætter hver standard imidlertid et andet benchmark (tabel 2).

Tabel 2 In vitro UVA-PF-bestemmelsesprotokol sammenligning

FDA 2007-standarden anvender den modificerede Diffey-fraktion, hvor arealet under UVA1-absorptionskurven (340nm til 400nm) opdeles i det samlede absorptionsområde for UVA og UVB (290nm til 400nm).14,15 FDA 2011 afskaffede dog den modificerede Diffey-fraktion af følgende grunde:

1. Denne fraktion giver betydelig opmærksomhed til UVA1-området, mens dette område ikke spiller en væsentlig rolle i forbindelse med frembringelse af skadelige hudvirkninger.
2. Hvis en eller flere af produktets bestanddele giver en høj absorption i UVA2-området med kort bølgelængde og en lav eller ingen adsorption i UVA1-området, opstår der et stort forhold, mens dette produkt ikke giver en bred vifte af absorption.
3. Dette foreslåede forhold viser ikke en pålidelig grad af beskyttelse mod UVA og gælder ikke andre steder i verden.
4. En måde at øge denne fraktion på er at reducere stoffer med høj absorption i UVA2- og UVB-områderne, men dette vil reducere beskyttelsesniveauet i disse områder af spektret (med andre ord, for at øge Diffey-fraktionen bør SPF falde).

I ISO 24443-standarden beregnes UVA-beskyttelsesfaktoren i overensstemmelse med PPD-testresultaterne. De to standarder CEN og FDA 2011 anser den kritiske bølgelængde-metode for at være hensigtsmæssig.

A (λ) er den gennemsnitlige absorption ved hver bølgelængde, og d (λ) er bølgelængdeintervallet mellem hver beregning.

Den kritiske bølgelængde er den bølgelængde, hvor området under absorptionskurven udgør 90 % af det samlede areal under UV-absorptionskurven.

FDA konkluderede, at den ledsagende test af den kritiske bølgelængde (til måling af omfanget af UVB- og UVA-beskyttelse) og SPF-testen (til måling af størrelsen af UVB- og UVA-beskyttelsen) gav en fuldstændig måling af bredspektrumsegenskaben. For at et produkt kan mærkes med en bredspektrumsangivelse, skal det generere en kritisk bølgelængde på mindst 370 nm.

Testplader

Pladerne spiller som belastningssted en afgørende rolle i testen. Blandt pladerne af kvarts, herunder PMMA (polymethylmethacrylat), hydreret kollagen, epidermal hud og transpore tape, er PMMA-pladerne valgt på grund af deres nyhed. Følgende grunde er afgørende faktorer for at foretrække den frem for de andre pladetyper:

1. Den er billigere end kvarts.
2. Den er klar til brug, og den behøver ikke at blive rengjort eller opkradset på ny.
3. Det anvendes i mere end et årti.

Med hensyn til pladestørrelsen, når plader med dimensioner på 16 cm2 giver acceptable resultater, er det ikke nødvendigt at anvende plader med større dimensioner (10,2 cm). Hvad angår graden af ruhed af disse plader, foreslår standarden FDA 2011 sider med en ruhed på 2 til 7 µg, og ISO 24443 tilbyder en ruhed på 6 mikron. Valget af en konstant ruhed på 6 µm, der er identisk med alle disse test, synes rimeligt.

Reference solcremeformulering

I henhold til tabel 2 er det kun ISO 24443, der har et solcremeprodukt som reference. Referencesolcreme S2 giver en UVA-PF på 12,7.

Strålingskilde

Hvor strålingsgennemgangen gennem de plader, der er dækket af produktet, måles, udføres en bestrålingsfase for disse produkter for at overveje den optiske stabilitet. FDA 2011 mener, at solsimulatorens (FDA 2007 foreslåede anordning) stråling filtreres på en sådan måde, at dens energi ved bølgelængder under 300 nm er mindre end spektrofotometrets følsomhed, selv når der ikke er påført solcreme på pladen (dvs. at passagehastigheden er 100 %).

Derfor foreslår FDA 2011 en strålekilde, der producerer en kontinuerlig spektralfordeling af UV-stråling fra 290 til 400 nanometer. Standard CEN foreslår en solsimulator udstyret med filtre.

Bølgelængdeintervaller mellem måleoperationer

For at måle passagen af udstrålet UV-stråling ved hver bølgelængde skal stråleintervallerne være intermitterende. Disse intervaller er indstillet i intervallerne 1nm og 5nm i henhold til tabel 2. Det blev nævnt i FDA 2011: I indlæggene blev det anført, at specifikation af et mindre interval ville give mere nøjagtige resultater, og det blev bemærket, at de nuværende spektrometre er i stand til at foretage målinger med intervaller på 1 nm.

Spektrometerets dynamiske område

Dynamisk område er en af indikatorerne til kalibrering af UV-spektrofotometeret. Spektrometerets dynamiske område skal være tilstrækkeligt til nøjagtigt at måle passagen af højabsorberende solcremer ved alle UV-bølgelængder (290nm til 400nm).

Produktbelastningsmængde

Mængden og processen for belastning af produktet på pladens ru sektion er specificeret i hver standard. For at sikre nøjagtighed i mængden af produktpåfyldning kan vi anvende pipettevægtmålemetoden før og efter påfyldning eller ved hjælp af tæthedsfaktor. Produktet lægges i dråber af samme volumen. FDA 2007, CEN og ISO 24443 anvender en værdi på henholdsvis 2 og 2 mg/cm2 og 1,3 mg/cm2. FDA mener, at UV-passage fra et tykt lag på 2 mg/cm2 er mindre og fører til inkonsistente reaktioner. Derfor har FDA fastsat belægningsmængden til 0,75 mg/cm2 for at sikre, at UV-passageniveauet ligger inden for UV-detektorernes dynamiske område.

Produktfordelingsmåde

Den jævne spredning af solbeskyttelsesproduktet på pladen påvirker testens nøjagtighed betydeligt. Som det fremgår af tabel 2, kan spredningen ske enten i én fase eller i to faser med brug eller ikke-brug af en fingerseng. FDA 2011 anser tofasespredning for at være en mere effektiv måde at opnå et fast og tykt lag på. Dette bidrager til en bedre fordeling for en lang række lægemiddelformer end den 10-s bløde fordelingsteknik, og det svarer også til forbrugernes faktiske brug. Derfor synes FDA 2011- og ISO 24443-udtalelsen på en produktspredningsmåde at være de bedste muligheder.

Pre-Irradiation Dose

Denne operation udføres for at kontrollere reduktionen af den optiske stabilitet. Solcremen lægges på pladen og udsættes derefter for en strålekilde. Ifølge FDA 2011 er solstrålingen på et tidspunkt og et sted på jordoverfladen lige stor for produkter med høj eller lav SPF og UVA-PF, og derfor er det ikke logisk at angive præ-strålingsdosis i form af en SPF- eller UVA-PF-fraktion. FDA 2011 foreslår derfor, at strålingsdosis før bestråling er en konstant værdi. FDA modtog oplysninger, som viste, at produkter, der indeholder avobenzon, blev fuldstændig ødelagt ved eksponering for en dosis svarende til 2-3 MED (Minimal Erythemal Dose).

Dette er det værste scenarie for optisk nedbrydning, da avobenzon er det mest ustabile solbeskyttelsesmiddel mod lys i solcreme-monografier. 1MED i hudtype 2 svarer til 250 J/m2. I FDA 2011 er præ-strålingsdosis således fastsat til 4MED, der svarer til 800 J/m2.

Antal af strålepassagemåling

Efter eksponering af produkterne for præ-strålingsdosis placeres pladerne, der er dækket med produktet, i spektrofotometeret for at måle passagen. Ifølge FDA 2011 udtalelse (5 gange måling fra 3 sider), når der opnås et tilfredsstillende resultat med færre beregninger, er det ikke nødvendigt med mere tid og flere omkostninger.

Statistik og beregninger

I henhold til CEN fås den kritiske bølgelængde ud fra følgende formel:

hvor λC er den kritiske bølgelængde, og MPF er den monokromatiske beskyttelsesfaktor, som er den inverse af transmittansen ved en given bølgelængde.

I henhold til ISO 24443 beregnes oprindeligt den individuelle UVA-beskyttelsesfaktor (UVA-PFI) på hver base (mindst 4 baser) i henhold til følgende formel:

hvor P(λ) er PPD-handlingsspektret.

I(λ) er den spektrale bestråling, der modtages fra UVA-kilden.

Ae(λ) er den gennemsnitlige monokromatiske absorbans af testproduktlaget efter UV-eksponering.

d(λ) er bølgelængdespringet (1 nm).

C er justeringskoefficienten. De oprindelige absorbanskurveværdier multipliceres med en skalarværdi “C”, indtil de in vitro beregnede SPF-værdier er lig med den in vivo målte SPF. Dette sker ved en iterativ beregningsproces. De oprindelige absorbansværdier ganget med denne “C”-værdi bliver den justerede solbeskyttelsesabsorptionskurve, der anvendes til bestemmelse af den oprindelige UVA-PF0-værdi og eksponeringsdosis. “C”-værdien ligger typisk mellem 0,8 og 1,6 for at sikre en valid fortolkning. Hvis den ligger uden for dette interval, bør der udarbejdes nye prøver for at validere de oprindelige observationer.

Sådan beregnes den gennemsnitlige UVA-PF-beregning i henhold til nedenstående formel:

Hvis denne betingelse Confident interval (CI) n er opfyldt, er testen gyldig; i modsat fald bør antallet af baser øges, så længe betingelsen er opfyldt.

Hvis den nævnte betingelse ikke er opfyldt efter anvendelse af 10 baser, erklæres testen for ugyldig.

I henhold til FDA 2011- og FDA 2007-standarderne beregnes UV-passageniveauet ud fra følgende formel:

Målinger af den spektrale bestråling, der for hver bølgelængde transmitteres gennem kontrol-PMMA-plader belagt med 15 µl glycerin.

Målinger af den spektrale bestråling, der for hver bølgelængde λ transmitteres gennem den PMMA-plade, der er dækket af solbeskyttelsesproduktet. Den gennemsnitlige absorption i hver bølgelængde ( beregnes ud fra den negative logaritme af den gennemsnitlige UV-gennemgang på følgende måde:

I henhold til FDA 2011 beregnes den kritiske bølgelængde ud fra denne formel;

I henhold til FDA 2007 beregnes Diffey-fraktionsforholdet på følgende måde:

UVA I-areal pr. enhed λ er givet som:

UV-areal pr. enhed λ er givet som:

Konklusion

Den rolle, som UVA spiller i forbindelse med forekomsten af hudskader, gør brugen af solbeskyttelsesprodukter, der beskytter huden mod UVA og UVB, uundværlig. Til vurdering af UVA-PF foretrækkes in vivo-metoden på grund af dens præcision og repeterbarhed samt simulering af de faktiske anvendelsesbetingelser for mennesker. Blandt FDA 2007- og CEN-standarderne, der indfører in vivo-PPD-metoden, har begge fordele og ulemper, således at anvendelse af en bedre metode i hvert enkelt tilfælde kan give bedre resultater.