Cellekultur, virusamplifikation og oprensning til SHAPE-MaP- og SPLASH-eksperimenter

Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) og Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler blev dyrket i Minimum Essential Medium (Merck), suppleret med 2 mM l-glutamin og 10 % FCS. Der blev fremstillet lagre af WSN (H1N1)-virus ved at inficere MDBK-celler med influenzavirus ved en infektionsmultiplikator (MOI) på 0,01. Viruslagre af Udorn (H3N2)- og PR8 (H1N1)-virus (PR8)-virus blev fremstillet ved at inficere MDCK-celler ved en MOI på 0,001 i tilstedeværelse af 0,8 μg ml-1 n-Tosyl-l-phenylalanin-chloromethylketon (TPCK)-behandlet trypsin (Merck). Virus blev indsamlet 2 d efter infektionen. Virusene blev oprenset ved ultracentrifugering: Først blev det inficerede cellekulturmedium klaret ved centrifugering ved 4 000 r.p.m. i 10 min. ved 4 °C efterfulgt af centrifugering ved 10 000 r.p.m. i 15 min. ved 4 °C. Viruset blev derefter oprenset ved centrifugering gennem en 30 % saccharosepude ved 25 000 omdrejninger i 90 min. ved 4 °C i en SW 32-rotor (Beckman Coulter). Den rensede viruspellet blev resuspenderet i en resuspensionsbuffer (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Vi bemærker, at hverken virion- eller RNA-tertiærstrukturer forstyrres ved ultracentrifugering30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP blev udført i henhold til offentliggjorte procotoler17; 1-methyl-7-nitroisatoic anhydrid (1M7) blev syntetiseret fra 4-nitroisatoic anhydrid som tidligere beskrevet33. Til eksperimenterne med in vitro transskriberet RNA blev hvert viralt RNA-segment syntetiseret fra en lineær DNA-skabelon ved hjælp af HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). Produkterne blev kontrolleret for størrelse og renhed på en 3,5 % polyacrylamidgelelektroforese (PAGE)-urea gel. Nøgne virale RNA-prøver blev fremstillet ved at rense WSN-partiklerne over saccharosepude som beskrevet tidligere. Rensede vira blev behandlet med 250 μg ml-1 proteinase K (Roche) i proteinase K-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS) i 40 min. ved 37 °C. Før modificeringen blev in vitro-transskriberet RNA og nøgne virale RNA-prøver foldet ved 37 °C i 30 min. i foldningsbuffer (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). 1M7 (opløst i vandfrit dimethylsulfoxid (DMSO; Merck)) blev tilsat til en slutkoncentration på 10 mM til det foldede RNA, og prøverne blev inkuberet i 75 s ved 37 °C. In virio-modifikationerne blev udført ved at tilsætte 1M7 direkte til oprenset virus. SHAPE-MaP-reagensernes evne til at trænge ind i virale partikler blev indledningsvis testet som tidligere beskrevet34 ved at udføre 32P-mærkede primerforlængelser på RNA ekstraheret fra SHAPE-MaP-reagensbehandlet virus ved hjælp af en NA-segment-targeting primer (5′-AATTGGTTCTCCAAAGGAGAGACG-3′). Parallelt med de 1M7-behandlede prøver blev kontrolprøverne behandlet med DMSO. n-methylisatoic anhydrid (NMIA; Thermo Fisher Scientific) SHAPE-MaP-reagenset blev også testet i virio. Eksperimenter med NMIA blev udført som beskrevet for 1M7, bortset fra at de oprensede virioner blev behandlet med NMIA i 45 min.

Sekventeringsbiblioteksforberedelse blev udført som tidligere beskrevet17 i henhold til randomer-arbejdsgangen. Kort fortalt blev RNA efter 1M7- eller kontrolbehandling renset ved hjælp af RNA Clean & Concentrator-5-sættet (Zymo Research). RNA’et blev reverse-transskriberet ved hjælp af Random Primer Mix (New England Biolabs) med SuperScript II (Invitrogen) i MaP-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM dithiothreitol og 0,5 mM deoxynukleosidtriphosphat). Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) blev anvendt til at forberede DNA-bibliotekerne. De endelige PCR-amplifikationsprodukter blev størrelsesselekteret ved hjælp af Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) og kvalitetsvurderet med Agilent DNA 1000-kittet (Agilent Technologies) på et Bioanalyzer 2100-system (Agilent Technologies). For WSN, nøgent viralt RNA og in vitro-transskriberet RNA blev bibliotekerne sekventeret (2 × 150 basepar (bp)) på et HiSeq 4000-system (Illumina); for PR8- og Udorn-virus blev bibliotekerne sekventeret (1 × 150 bp) på et NextSeq 500-system (Illumina).

SPLASH

SPLASH-prøver blev fremstillet som tidligere offentliggjort24,35 , med visse ændringer, for to replikater af WSN-, PR8- og Udorn-virus og en enkelt replikat for hvert af H3N2-reassortant-virusserne. Renset virus blev inkuberet med 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) og 0,01 % digitonin (Merck) i 5 minutter ved 37 °C. Virus blev spredt på en 6-hullers skål, dækket med en glasplade, lagt på is og bestrålet i 45 min. med en UVP Ultra Violet Product Handheld UV-lampe (Thermo Fisher Scientific). Krydsbundet virus blev behandlet med proteinase K, og viralt RNA blev ekstraheret ved hjælp af TRIzol (Invitrogen). En alikvot af det ekstraherede virale RNA blev anvendt til påvisning af biotinindarbejdelse ved hjælp af et kemiluminescerende nukleinsyre-detektionsmodul-sæt (Thermo Fisher Scientific) på en Hybond-N-nylonmembran (GE Healthcare Life Sciences). Resten af det ekstraherede virale RNA blev fragmenteret ved hjælp af NEBNext Magnesium RNA-fragmenteringsmodulet (New England Biolabs) og størrelsesselekteret for fragmenter, der er kortere end 200 nt, ved hjælp af RNA Clean & Concentrator-5-kittet. Prøverne blev beriget for biotinyleret viralt RNA ved hjælp af Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perler (Thermo Fisher Scientific); on-bead proximity ligation og psoralen-cross-link reversal blev udført som tidligere offentliggjort24,35. Sekventeringsbiblioteker blev fremstillet ved hjælp af det kommercielle SMARTer smRNA-Seq-kit (Clontech Laboratories). Den endelige størrelsesudvælgelse blev foretaget ved at køre de PCR-amplificerede sekventeringsbiblioteker på en 6 % PAGE-gel (Thermo Fisher Scientific) i Tris/borsyre/EDTA (TBE), idet der blev udvalgt DNA på 200-300 bp. Libarierne blev sekventeret 1 × 150 bp på et NextSeq 500 System.

Bearbejdning af SHAPE-MaP-sekventeringsreads

Sequenceringsreads blev trimmet for at fjerne adaptorer ved hjælp af Skewer v0.2.2 (ref. 36). SHAPE-MaP-reaktivitetsprofilerne blev genereret ved hjælp af den offentliggjorte ShapeMapper2-pipeline37 , som justerer læsningerne til referencegenomet og beregner mutationsrater ved hver nukleotidposition. Mutationshastighederne konverteres derefter til SHAPE-MaP-reaktivitetsværdierne defineret som:

hvor mutr1M7 er nukleotidmutationsraten i den 1M7-behandlede prøve, og mutrDMSO er mutationsraten i den DMSO-behandlede prøve. Alle SHAPE-MaP-reaktiviteter blev normaliseret til en tilnærmelsesvis 0-2-skala ved at dividere SHAPE-MaP-reaktivitetsværdierne med den gennemsnitlige reaktivitet af de 10 % mest stærkt reaktive nukleotider efter udelukkelse af outliers (defineret som nukleotider med reaktivitetsværdier, der er >1,5 interkvartilområdet). Høje SHAPE-MaP-reaktiviteter indikerer mere fleksible (dvs. enkeltstrengede) regioner af RNA, og lave SHAPE-MaP-reaktiviteter indikerer mere strukturelt begrænsede (dvs. baseparrede) regioner af RNA.

Behandling af SPLASH-sekventeringsreads

Sekventeringsreads blev trimmet for at fjerne adaptorer ved hjælp af Skewer v0.2.2.2 (ref. 36). STAR v.2.5.3 (ref. 38) blev anvendt til at tilpasse læsningerne til det relevante virusreferencegenom (Supplerende tabel 2). Kun de chimære læsninger, hvor mindst 20 nt blev afstemt med referencesegmenterne, blev anvendt i den videre behandling (STAR-parameter: -chimSegmentMin 20). Chimeriske læsninger blev deduplikeret ved hjælp af CIGAR-strenge og alignmentpositioner. CIGAR-strenge i hver læsning blev behandlet for at finde læsningens start- og slutkoordinater. Koordineringen af de kimeriske læsninger blev anvendt til at fremstille en matrix af sekvensinteraktioner i R-softwaren. Diskrete loci i matrixen blev udvalgt og individuelt tilpasset med en Gaussisk kurve baseret på læseoverlapningsintensiteten for at definere et interaktionsvindue; interaktionsvinduer med komplekse overlappende loci blev adskilt i individuelle vinduer. Interaktionsvinduets bredde blev brugt til at bestemme start- og slutkoordinaterne for hver interaktion; antallet af læsninger, der var inden for (eller delvist inden for) dette område, blev brugt som et mål for interaktionsfrekvensen. Til generering af figurer blev de 20 bedste interaktioner i hver virus visualiseret ved hjælp af circlize-pakken v.0.4.5 (ref. 39) i R v.3.5.1. Det fuldstændige sæt af interaktionslokaliteter findes i supplerende tabel 2. Til qPCR-validering af interagerende loci blev psoralen-krydsede prøver fremstillet og beriget som beskrevet tidligere, men med en forkortet fragmenteringstid (3 versus 4 min) for at generere længere RNA-fragmenter. RNA blev polyadenyleret med Poly(A) Polymerase (Takara Bio), og komplementært DNA blev genereret ved hjælp af smRNA dT Primer (Takara Bio) og PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) i henhold til producentens instruktioner. Der blev udført en 50-cyklus qPCR i henhold til producentens anvisninger på et StepOnePlus-instrument (Applied Biosystems) ved hjælp af Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) og primerpar for at teste for intersegmentinteraktioner. Primersekvenser er angivet i supplerende tabel 3. Efter 50 cyklusser af qPCR-amplifikation blev produkterne opløst ved 8% PAGE (29:1 acrylamid/bis-acrylamid, 1× TBE-buffer) og visualiseret med transillumination med blåt lys.

RNA-strukturprædiktioner

The IntaRNA algorithm v.2.3.1 (ref. 40) blev anvendt til at forudsige RNA-RNA-interaktioners evne til at forekomme i de regioner, der blev identificeret under SPLASH-analysen, under anvendelse af indstillingerne Exact mode (-mode E) og no seed constraint (-noSeed). SHAPE-MaP-reaktiviteterne blev medtaget i modelleringen af RNA-RNA-interaktioner (-tShape og -qShape). Permuterede datasæt blev genereret ved tilfældigt at blande de specifikke interaktionspartnere, der blev identificeret af SPLASH, og vurdere interaktions ΔG-energierne ved hjælp af IntaRNA. Signifikansen af forskellen mellem sandsynlighedsfordelingerne af ΔG-energierne i forbindelse med de SPLASH-identificerede intermolekylære RNA-interaktioner i forhold til de permuterede datasæt blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon rank-sum-testen i R-softwaren. IntaRNA-strukturprædiktionerne blev derefter brugt til at trimme interaktionsregionerne til de nukleotider, der er involveret i baseparringerne. I de tilfælde, hvor SHAPE-MaP-data ikke var tilgængelige (PR8-reassortanter med H3N2-virus), blev forfoldning af hver RNA-streng (“tilgængelighed”) deaktiveret i IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). Til validering i forhold til kendte strukturer blev RNA-sekundærstrukturdata udtrukket fra RNA3Dhub-databasen41 , baseret på de kryogene elektronmikroskopistrukturer af 80S-ribosomet42 (PDB: 6EK0) og fra det tredobbelte lille nukleare ribonukleoprotein-spliceosomale kompleks U4/U6.U543 (EMDB: EMD-2966). ReferencerNA-sekvenser blev korrigeret for at matche sekvenser fra kvæg (MDBK) for ribosomalt RNA og U4/U6 små nukleare RNA’er som tidligere beskrevet44. Til forudsigelser af den intramolekylære RNA-struktur blev ViennaRNA-pakken v.2.0 (ref. 45) anvendt. RNAfold-kommandoen blev anvendt til at forudsige sekundære RNA-strukturer og partitionsfunktioner for hvert segment. SHAPE-MaP-reaktiviteter blev inkluderet som pseudoenergibegrænsninger. En 50 nt glidende medianvindue korrelationsanalyse mellem ex virio- og in virio SHAPE-MaP-reaktivitetsprofilerne blev anvendt til at bestemme omfanget af SHAPE-MaP-korrelation mellem T7-transskriberet og vRNP-associeret RNA. Vi fandt, at der ikke fandtes nogen korrelation >150 nt; derfor satte vi den maksimale parringsafstandsbegrænsning for struktur- og partitionsfunktionsprædiktioner til 150 nt. For intramolekylære strukturprædiktioner indstillede vi nukleotiderne inden for promotorregionen til at være enkeltstrengede.

Cellekultur til reverse-engineering af influenzavirus

MDCK-celler og humane embryonale nyreceller (HEK 293T) blev hentet fra en eksisterende samling i Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne. MDCK-celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Sigma-Aldrich), og HEK 293T-celler blev dyrket i DMEM (Thermo Fisher Scientific). Begge medier var suppleret med 10 % varmeinaktiveret FCS, 2 mM l-glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 24 μg ml-1 gentamicin, 50 μg ml-1 streptomycin og 50 IU ml-1 penicillin. Kokulturer af MDCK-celler og HEK 293T-celler til transfektion blev etableret i Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) med 50 μg ml-1 streptomycin og 50 IU ml-1 penicillin.

Konstruktion af reverse-engineered influenzavirus

Individuelle gensegmenter fra PR8-, Udorn-, Mem71 (H3N2)-, Mem71 (H3N2)-, PC73 (H3N2)- og Wyo03 (H3N2)-virus blev reverse-transskriberet og klonet ind i pHW2000-plasmider46. De omvendt genetisk afledte virus indeholdt enten et PR8-, Udorn-, Mem71-, PC73- eller Wyo03 PB1-gen med enten et wild-type eller modificeret NA-gen i en genetisk baggrund, der omfattede seks segmenter fra PR8-virus (PB2, PA, HA, NP, M og NS). Det modificerede NA-gen (Wyo03UdSub) var afledt af Wyo03 og indeholdt fire substitutioner i Udorn-NA-sekvensen: nukleotiderne G943A, C938U, U933C og G923A. Tre af disse fire nukleotidændringer var tavse, mens den fjerde (A534G) resulterede i en konservativ ændring fra lysin til arginin (K172R). Komplementære fragmenter, der inkorporerer disse ændringer, blev genereret ved PCR og sat sammen ved endnu en PCR-runde ved hjælp af segmentspecifikke primere, der indeholder BsmBI-restriktionssteder47; produktet blev klonet ind i pHW2000-ekspressionsvektoren til virusredning. Primersekvenser er angivet i den supplerende tabel 3. Reddede vira blev amplificeret i 10-d embryonerede hønseæg. Infektiøs allantoisk væske blev titreret for virusindhold ved plakedannelse i MDCK-celler48 og opbevaret ved -80 °C.

Bestemmelse af viral replikationskinetik af reverse-engineered virus

Replikationsegenskaberne for de reverse-engineered virus blev bestemt ved at inficere MDCK-celler ved en MOI på 0,01. Efter 1 times absorption (ved t = 0 h) blev inokulumet fjernet, og cellerne blev vasket og inkuberet ved 37 °C, 5 % CO2 i RPMI 1640 suppleret med 2 mM l-glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 24 μg ml-1 gentamicin, 50 μg ml-1 streptomycin, 50 IU ml-1 penicillin og 1 μg ml-1 TPCK-behandlet trypsin (Worthington Biochemical Corporation). Cellekultur-supernatanter blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter infektionen og opbevaret ved -80 °C med henblik på analyse. Viraltiter blev bestemt ved plakedannelse på konfluente monolag af MDCK-celler.

Nine-plasmid competitive reverse-engineering af influenzavirus

Kompetitiv reverse-engineering af influenzavirus blev foretaget ved hjælp af en modificeret version af det omvendte genetiksystem med otte plasmider26 som tidligere beskrevet25. Kort fortalt blev plasmider, der koder for PB2-, PB1-, PA-, hæmagglutininin (HA), nukleoprotein (NP), matrixprotein (M) og ikke-strukturelt protein (NS) virale RNA-segmenter af PR8, kotransficeret med plasmider, der koder for neuraminidase (NA) viralt RNA og konkurrerende PB1 viralt RNA af enten Udorn, Mem71, PC73 eller vild-type eller modificeret Wyo03. Hvert plasmid (1 µg) blev blandet med FuGENE 6 transfektionsreagens (Promega) i Opti-MEM og tilsat til en samkultur af HEK 293T- og MDCK-celler. Seks timer efter transfektionen blev mediet erstattet med Opti-MEM suppleret med 50 μg ml-1 streptomycin og 50 IU ml-1 penicillin. Fireogtyve timer senere blev der tilsat TPCK-behandlet trypsin (1 μg ml-1), og supernatanten blev opsamlet efter yderligere 42 timer og opbevaret ved -80 °C. For at bestemme inkorporeringsfrekvenserne af de konkurrerende PB1-gener blev afkomsvirusserne i transfektionens supernatant underkastet et plaque-assay i MDCK-celler. Tilfældigt udvalgte plaques (ca. 36 pr. forsøg) blev plukket ved prøveudtagning gennem agarosen og resuspenderet i 0,05 % Triton-X100. Kilden til de konkurrerende gensegmenter blev identificeret ved gen-specifik kvantitativ RT-PCR ved hjælp af SensiFast probe no-ROX one-step RT-PCR-sættet (Bioline). Hver 20 μl reaktion blev udført ved hjælp af 5 μl plakplukket virussuspension, 10 μl 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix, 0,2 μl omvendt transkriptase, 0,4 μl Ribosafe RNaseinhibitor, 0,8 μl af hver 10 μM gen-specifik fremadrettet og omvendt primer og 0,08 μl af hver 25 μM gen-specifik sonde. Primer- og sonde-sekvenserne er angivet i supplerende tabel 3. RT-PCR-reaktionen blev inkuberet i 10 min. ved 45 °C, inden der blev foretaget qPCR-amplifikation i henhold til producentens anvisninger. De rapporterede værdier er kombinerede data fra 3-8 uafhængige transfektionseksperimenter for hver konkurrence.

Rapporteringsresumé

Flere oplysninger om forskningsdesign er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.