Abstract
Dette arbejde viser, at der foreligger en detaljeret beskrivelse af ultrastrukturen af de sekretoriske celler i de sydamerikanske havkat Rhamdia quelen pancreas-øer i bugspytkirtlen. Der fremlægges beviser til støtte for påstanden om, at α-granulerne består af en central og en ydre del med forskellige elektrontætheder og opløseligheder, at δ-cellerne højst sandsynligt er morfologisk ændrede, men levedygtige α-celler, og at β-granulerne muligvis besidder en gentagende understruktur og derfor kan repræsentere en intracellulær krystallinsk lagringsform af insulin.
1. Indledning
De Langerhansske øer blev opdaget hos kaninen af Langerhans i 1869. De blev imidlertid rapporteret af Stannius og Blockmann i teleoste ca. 20 år tidligere, og derfor omtales de også, om end mindre hyppigt, som Stannius- eller Blockmann-legemer. Langerhans-øerne er af endodermisk oprindelse og findes hos de fleste teleostere som små organer spredt i den exokrine del af bugspytkirtlen.
Fisken har ikke en selvstændig bugspytkirtel. Exokrint bugspytkirtelvæv kan findes spredt langs tarmkanalen. Den eksokrine bugspytkirtels acinærstruktur ligner meget pattedyrsstrukturen og består af celler med et meget mørkt, basofilt cytoplasma . Hos aktivt ædende fisk indeholder de et stort antal lyse eosinofile, sekretoriske granula. Der kunne skelnes mellem den endokrine bugspytkirtel-ø Langerhans-ø, og vævet omfatter α-celler (der producerer glukagonlignende peptid), β-celler (der producerer insulin) og d-celler (der producerer somatostatin) . Hos pattedyr og mennesker har de fleste af de tidligere elektronmikroskopiske beskrivelser af voksne menneskelige bugspytkirteløer været korte, og mindre dele af publikationerne er primært afsat til beskrivelser af β-celletumorer eller oversigtsartikler, der diskuterer den sammenlignende morfologi af øerne hos flere arter .
Fiskens bugspytkirtel viser sig ikke ofte at være en let tilgængelig kilde til væv til elektronmikroskopisk undersøgelse. Hovedfiskens bugspytkirtel ligner både anatomisk og udviklingsmæssigt pattedyrets bugspytkirtel, hvorimod store forskelle er tydelige hos andre fiskearter. Hos voksne zebrafisk indeholder bugspytkirtlen flere hovedøer omgivet af eksokrint væv. En hale af enkelte små øer, der er indlejret i exokrint væv og fedt, strækker sig caudalt langs tarmen. I modsætning hertil er β-cellerne hos tilapia (en anden glukosefølsom teleostfisk) placeret i Langerhans-øer langs mesenteriet, som ikke er omgivet af exokrint væv . Rhamdia quelen er en teleostartfisk og er en vigtig art for akvakultur i subtropiske klimaer. R. quelen findes fra det sydlige Mexico til det centrale Argentina, og opdræt af denne art breder sig mod det sydlige Brasilien .
I denne undersøgelse analyserer vi ultrastrukturen af Langerhans-øerne og beskriver i detaljer de forskellige typer sekretoriske celler i sydamerikansk havkat R. quelen.
2. Materialer og metoder
Fire opdrættede R. quelem to hunner og to hanner ( g; cm) fra Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) i den nordøstlige region af Argentina og udlejret i 200 L tanke, hvor de blev akklimatiseret i to uger før nekropsi. Fiskene blev opdrættet med filtreret ferskvand, der blev holdt ved 25 °C med en vandskift på 100 % om dagen. Fotoperioden blev justeret til 12 timer i mørke og 12 timer i lys. De blev håndfodret fire gange om dagen med kommercielt foder (Ganave). Fiskene blev euthaniseret med benzokain (500 ppm) og nekropseret, og prøver af fedt, der strækker sig caudalt langs tarmen, blev fikseret i 10% buffered formalin, indlejret i paraffin og farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E).
Små vævsfragmenter blev skåret i 1 mm store blokke og straks fikseret i fosfatbufferet glutaraldehyd (pH 6.9 ved 4°C), vaskes i Millonig’s opløsning og postfikseres i 1% osmiumtetroxid; vævsblokkene blev derefter dehydreret i en gradueret serie af ethanol-acetone, nedsænket i propylenoxid og indlejret i Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Schweiz). Tynde snit blev skåret med et LKB ultramikrotom og dobbelt farvet med uranylacetat og blycitrat før undersøgelse i et Jeol JEM-8T elektronmikroskop (Jeol, Tokyo, Japan).
3. Resultater
3.1. Lysmikroskopi
R. quelen har bugspytkirtel spredt i fedtvævet omkring den almindelige galdegang; dette ligger inden for et omtrent trekantet område, der er afgrænset overordnet af maven, fortil af leveren og underordnet af milten og galdeblæren. Hver Langerhans-ø er sammensat af relativt rent øvelsesvæv omgivet af eksokrint pancreas (figur 1). Der blev ikke observeret nogen forskelle mellem mænd og kvinder.
3.2. Elektronmikroskopi
β-cellerne, som normalt optager det indre af øerne, var almindeligvis, men ikke altid, adskilt fra det exokrine pancreas af de perifert beliggende α-celler (figur 2). β-cellernes ultrastrukturelle udseende var identisk i prøverne fra de fire fisk. De karakteristiske β-granuler var indeholdt i glatte, membranformede sække og var variable i størrelse og form. Rektangulære, firkantede, sekskantede og uregelmæssigt polygonale krystaller var synlige. Runde former var til stede, men mindre hyppigt (figur 2 til 5). Hvert granulat bestod af en eller flere krystallinske eller ustrukturerede former af varierende størrelse og form. Valget af fiksationsmiddel syntes ikke at have indflydelse på β-granulatets indre struktur. Inden for rammerne af den omsluttende membran virkede området omkring krystallerne tomt eller indeholdt et fint flockulent udfældningsprodukt, uanset hvilket fiksationsmiddel der blev anvendt. Ved højere forstørrelser var der undertiden en gentagende understruktur synlig i de krystaller, der var korrekt orienteret i forhold til snitplanet (figur 6 og 7). De talrige mitokondrier var spredt ud over hele cellen og fremstod som afrundede eller fyldige filamentøse strukturer. De var større og mere talrige end dem i β-cellen, men normalt mindre end dem i pancreasacinarcellerne. De talrige mitokondrielle cristae var for det meste orienteret på tværs, og mitokondrielle granula var til stede, men ikke fremtrædende. Cisternerne i det granulære endoplasmatiske reticulum var normalt korte eller blæreformede (figur 2 til 4). Det granulære endoplasmatiske reticulum og de frie ribosomer var ikke et så fremtrædende træk ved β-cellerne som i acinær- eller β-cellerne. De β-celler med få sekretoriske granula var normalt mere rigt udstyret med ribosomer og granulært endoplasmatisk retikulum, som da hyppigere var cisternisk konfigureret (figur 5).
Golgi-komplekset var mere fremtrædende efter aldehydfiksering, og komponentstrukturerne var mere udvidede (figur 2). Efter anvendelse af disse fiksationsmidler var tæt amorf materiale lejlighedsvis synligt inden for Golgi-blærer og kan repræsentere umodne granula eller forstadier til β-sekretoriske granula. β-cellekerner var normalt kugleformede og relativt glatte i konturen. Cellemembranen i tilstødende ø-celler lå tæt på desmosomer, men var ikke ofte forbundet med disse. I forbindelse med tre eller flere cellers sammenfald var de begrænsende membraner ofte snoede, og cellerne var snoet ind i hinanden (figur 2 og 9). Multivesikulære cytoplasmatiske inklusioner, der lignede ceroid, var iøjnefaldende i de fleste β-celler (figur 2, 7, 9 og 8). Forekomsten og hyppigheden af disse inklusioner blev ikke mærkbart påvirket af den primære anvendelse af osmisk syre eller aldehyd som fiksationsmiddel, og der var ingen åbenlys sammenhæng mellem tilstedeværelsen af disse granula og de morfologiske tegn på fysiologisk aktivitet i cellerne. α-cellernes ultrastruktur var den samme i alle fire vævsprøver. Størrelsen og formen af disse celler og af deres kerner var ikke signifikant forskellige fra normale β-celler (figur 2 og 7). Selv om man lejlighedsvis fandt en α-celle med en uregelmæssigt formet eller en indadskåren kerne, optrådte dette ikke med tilstrækkelig hyppighed til at tjene som et nyttigt differentieringskriterium. α-cellens cytoplasmiske granula blev bevaret ved primær osmiumfiksering som tætte, kugleformede legemer af varierende størrelse og var indeholdt i løstsiddende, glatmembranede sække (figur 7 og 9). De var større end β-granulerne, men betydeligt mindre end zymogengranulerne i acinarcellerne (figur 2). De slanke, aflange mitokondrier var moderat i antal og mindre end β-cellernes og besad cristae, som normalt var orienteret på tværs. Det granulære endoplasmatiske reticulum var ofte cisternel i sin konfiguration og var mere rigeligt end i β-cellerne (figur 9). Golgikomplekset var, når det var synligt, af moderat størrelse. Tætte amorfe materialer i Golgiblærer og cisterner, formentlig forløbere for de sekretoriske granula, var mere almindelige i α-cellerne end i β-cellerne (figur 10). Ceroidlegemer var, selv om de ofte var synlige, mindre talrige end i β-cellerne (figur 2 og 3). De sække, hvori α-granulerne befinder sig, syntes derfor at være helt fyldt, og det blev konkluderet, at granulerne består af en afrundet indre tæt kerne og en ydre mindre elektrontæt kappe, som var fraværende efter osmiumfiksering (figur 3 og 9) og derfor måske er mere opløselige. Der var ingen konsistent understruktur synlig i hverken de indre eller perifere dele af α-granulerne. Der blev på intet tidspunkt set celler, der kunne tolkes som overgangsformer mellem α-celler og β-celler. α-granulaerne, herunder både de ydre og indre mere tætte dele, var sammenlignelige i samlet størrelse med “δ-granulaerne”. Desuden findes der mellemliggende celler, som indeholdt granula af begge typer, hvilket tyder på, at δ-cellerne i virkeligheden var modificerede α-celler (figur 10). δ-cellerne blev visualiseret, selv om de næsten altid var placeret blandt α-cellerne, og de er blevet identificeret og ultrastrukturelt adskilt fra α-cellerne på grundlag af den lavere elektrontæthed og den større samlede størrelse af deres sekretoriske granula. Desuden findes der intermediære celler, som indeholdt granula af begge typer, hvilket tyder på, at δ-cellerne i virkeligheden var modificerede α-celler (figur 11).
Selv om der var et omvendt forhold mellem antallet af sekretoriske granula og fremtrædende Golgi-kompleks og granulært endoplasmatisk retikulum, blev der ikke observeret noget mønster for frigivelse af α- eller β-granula. En tynd basalmembran og varierende mængder af bindevæv adskilte normalt pancreasøerne fra de tilstødende acinærceller (figur 2). I nogle tilfælde var der imidlertid ingen basalmembran mellem øl- og akinærceller, som så kun var adskilt af det smalle interstitielle rum. De fenestrerede kapillære endothelceller var altid adskilt fra dem af mindst den kapillære basalmembran (figur 9). Andre støtteelementer, herunder kollagen og elastiske vævskomponenter, var også undertiden til stede. Der blev ikke observeret nogen forskelle mellem hanner og hunner.
4. Diskussion
Fiskens β-celler adskilles let fra α-cellerne på grund af morfologien af de sekretoriske granula. Den hyppige tilstedeværelse af kantede underenheder og den tilsyneladende gentagende understruktur tyder på en krystallinsk natur for β-granulerne. Forsøg på at opløse og måle dimensionerne af et krystalgitter har endnu ikke været vellykkede. Når sekretoriske granula blev visualiseret i nærheden af Golgi-komplekset, blev der normalt ikke observeret krystallinske underenheder. Det er derfor fristende at spekulere i, at de ikke-krystallinske granula eller det amorfe materiale i Golgi-komplekset repræsenterer en anden kemisk eller fysisk form af insulin eller insulinproteinkomplekset end de krystallinske underenheder i granulaen. Det vides ikke, om disse forskellige morfologiske former inden for β-granulerne har forskellige opløseligheder og måske forskellige mønstre eller frigivelsesmønstre som reaktion på fysiologisk efterspørgsel. Sekretoriske granula blev ikke observeret i cisternerne eller vesiklerne i det granulære endoplasmatiske reticulum. Det antages, at Golgikomplekset, som det er tilfældet med andre proteinudskillende celler, fungerer til at koncentrere eller “pakke” det produkt, der syntetiseres i det granulære endoplasmatiske retikulum . Det ville logisk følge heraf, at de glatte membransække, hvori de sekretoriske granula er indeholdt, stammer fra Golgimembraner snarere end fra det granulære endoplasmatiske retikulum.
Den α-cellerne med deres store, afrundede, tætte sekretoriske granula ligner ganske meget α-cellerne hos andre arter. Selv om α-cellernes granula varierer meget i dimension, syntes de fleste celler at besidde et sortiment af granula af forskellig størrelse, hvilket udelukker en underklassificering af denne celletype, som det er blevet foreslået for andre arter . På nuværende tidspunkt er der ikke offentliggjort fysiologiske data til støtte for eksistensen af en “δ-celle” i fiskens bugspytkirteløer. De forskellige hovedpersoner har støttet δ-cellernes eksistens med data baseret på lysmikroskopiske undersøgelser af kapricious silver, phosphotungstic acid-hematoxylin og andre granulatfarvninger eller elektronmikroskopiske undersøgelser af dårligt bevarede væv. De mikrografer, der præsenteres her, støtter den opfattelse, som Bloom overvejede i 1931 og efterfølgende Gomori i 1941, at δ-cellerne kunne repræsentere modificerede α-celler.
Overgangen fra den typiske α-granule, med indre tætte og ydre mindre tætte dele, til en δ-granule af omtrent samme størrelse med ensartet, men nedsat tæthed, ledsages ofte af et gradvist tab af morfologisk integritet eller farvestyrke af mitokondrier, Golgi-komplekset og de membranøse komponenter af det granulære endoplasmatiske reticulum. De intakte og levedygtige kerner og det vedvarende lille antal frie ribosomer og ceroidlegemer tyder på, at de såkaldte δ-celler er levedygtige selv i det formodede slutstadium af denne overgang, dvs. når selve sekretoriske granula ikke længere er synlige, og alle cytoplasmatiske organeller ud over ceroidgranula og ribosomer er fraværende. I mangel af fysiologiske data, der tildeler δ-cellerne en funktion, og i mangel af mere overbevisende morfologiske beviser for en separat celletype, er det håbet, at præsentationen her af en sandsynlig overgang fra α-celler til δ-celler vil blive accepteret som den mest sandsynlige forklaring på den tredje granulære celle i Bloom hos mennesker . Betydningen af disse levedygtige, men ændrede α-celler er ikke kendt. Selv om α- og β-celler, enkeltvis eller i små klynger, kan ses inden for acini og dukter, blev der på intet tidspunkt i nogen af de fire undersøgte pancreatiske prøver set nogen mellemformer mellem acinær- og ø-celler eller dukt- og ø-celler, som Nakamura og Yokote havde foreslået (4).
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.
Akkreditering
L. A. Romano modtog produktivitetsforskningsstipendier fra det brasilianske forskningsråd, CNPq (proces nr. PQ 301002/2012-6).