2.19.2.3.3 Condiciones de elución

Las soluciones de elución efectivas deberían interrumpir idealmente las interacciones analito-anticuerpo sin afectar negativamente a los Abs inmovilizados. Un desplazador es una molécula de reacción cruzada altamente concentrada capaz de inducir una desorción bioespecífica. Las moléculas del desplazador compiten con las moléculas del analito unido, y el gran exceso de desplazador asegura una desorción cuantitativa del analito. Para un rendimiento óptimo, el desplazador tiene que cumplir varios criterios (1) una alta reactividad cruzada con los anticuerpos inmovilizados, (2) un tiempo de retención significativamente diferente al de los analitos porque el gran exceso provoca un pico prominente que puede interferir fácilmente con la detección de los analitos, (3) buena estabilidad y alta pureza porque las impurezas presentes a niveles tan bajos como el 0,01-0,1% pueden perturbar el cromatograma, y (4) bajo precio, características no tóxicas, ausencia en muestras reales y baja detectabilidad en comparación con los analitos. Además, es necesario un gran volumen de solución de elución, lo que impone la reconcentración en un soporte SPE clásico antes del análisis. En consecuencia, se prefieren las condiciones de elución que permiten la recuperación completa del analito objetivo con un pequeño volumen de elución.

Los iones caotrópicos se utilizan habitualmente para la elución de moléculas grandes como las proteínas. Estos iones alteran la estructura del agua alrededor de las moléculas grandes, es decir, los anticuerpos y las moléculas objetivo, lo que induce una ruptura de las interacciones hidrofóbicas en las estructuras de las moléculas grandes y entre el analito y el anticuerpo. Los iones caotrópicos más comunes son los iones cloruro, yoduro, perclorato y tiocianato, a concentraciones entre 1,5 y 8 mol l-1. Sin embargo, las diversas soluciones acuosas que pueden aplicarse con éxito para la desorción de proteínas de la SI se mostraron incapaces de desorber moléculas pequeñas. Es probable que la desorción de la proteína se base principalmente en los cambios en la estructura de la proteína unida (desnaturalización parcial), y no en los cambios en la estructura de los anticuerpos inmovilizados. Por lo tanto, la elución de las moléculas pequeñas, que no son sensibles a la desnaturalización, necesita condiciones mucho más rigurosas. Además, con un aumento de la temperatura de 4 a 43 °C, la constante de disociación de las interacciones anticuerpo-analito puede aumentar en dos órdenes de magnitud. Este método no es suficientemente eficaz para aplicarlo a la elución de moléculas pequeñas. La elución con soluciones de pH bajo se lleva a cabo a menudo para desorber moléculas pequeñas de IS, pero se requieren tres unidades de pH desde el punto isoeléctrico del anticuerpo. Este tipo de elución (cambio de pH sin alterar la fuerza iónica) evita dañar los anticuerpos lábiles. Un inconveniente es que se siguen necesitando grandes volúmenes para la desorción completa, con lo que disminuyen los factores de enriquecimiento asociados a los procedimientos de extracción.

Una elución eficiente de moléculas pequeñas a partir de un SI puede lograrse con un volumen reducido de una mezcla de agua y modificador orgánico. Como ejemplo, la figura 6 presenta el perfil de elución de dos herbicidas, el isoproturón y la atrazina, tras la percolación de una muestra de agua enriquecida con cada analito en su correspondiente IS. Se evaluaron varios disolventes de elución (metanol, etanol y ACN) mezclados con agua.

Figura 6. Perfiles de elución de la atrazina, el isoproturón, el 2,4,6-triclorofenol y el pentaclorofenol a partir de sus correspondientes IS utilizando soluciones de elución que contienen cantidades crecientes de un disolvente orgánico en agua acidificada o no acidificada tras la percolación de muestras de agua a las que se ha añadido cada analito. ACN, acetonitrilo; MeOH, metanol; EtOH, etanol; AA, ácido acético; TFA, ácido trifluoroacético.

Los perfiles de elución resultantes dependen en gran medida de la naturaleza del disolvente. Los tres disolventes ensayados permiten la elución completa de ambos analitos. Sin embargo, el ACN presenta la mayor fuerza de elución: el menor contenido de este disolvente proporciona una elución completa de ambos analitos. Un contenido de ACN del 40% y del 60% es suficiente para recuperar el isoproturón y la atrazina, respectivamente, mientras que se requiere un 60% y un 80% de metanol. En este caso, la fuerza de elución del disolvente parece estar relacionada con su naturaleza hidrofóbica, siendo el ACN (parámetro de solubilidad de Hildebrand δ = 24,3 MPa1/2) menos polar que el etanol (δ = 26,0 MPa1/2) y el metanol (δ = 29,7 MPa1/2). Estos resultados parecen indicar que las interacciones entre los herbicidas y sus correspondientes anticuerpos son principalmente de naturaleza hidrofóbica. La presencia de disolventes no polares reduce el componente de unión hidrofóbica de la interacción anticuerpo-analito. Sin embargo, también afecta a la estabilidad de los enlaces hidrofóbicos, manteniendo la estructura terciaria del anticuerpo, y da lugar a la liberación del antígeno. Estos ejemplos relacionados con la elución de la atrazina o del isoproturón a partir de su correspondiente IS muestran que se obtendrá una elución eficaz añadiendo directamente una cantidad elevada de metanol o ACN, del 70 al 80%, en la fracción de elución. Esta elevada cantidad de modificador orgánico permitirá reducir al máximo el volumen de la fracción de elución, permitiendo así la concentración del analito en el eluato. Hay que tener cuidado de que la elección del modo de unión sea compatible con estas condiciones de elución. El uso de la unión no covalente impide la posibilidad de aplicar una cantidad tan elevada de modificador sin el riesgo de interrumpir la unión de los anticuerpos del sorbente. El uso de un proceso sol-gel para la inmovilización de anticuerpos también limita la posibilidad de utilizar una gran cantidad de disolvente orgánico. Se ha demostrado que una gran cantidad de modificador orgánico, como los anticuerpos, provoca la lixiviación de los anticuerpos de la matriz sol-gel.8

A veces se requiere una combinación de disolvente orgánico y ácido orgánico. La figura 6 también presenta el perfil de elución del 2,4,6-triclorofenol y el pentaclorofenol de un IS anti-pentaclorofenol utilizando una mezcla hidro-orgánica con y sin añadir un ácido a la solución de elución. El triclorofenol pudo recuperarse completamente utilizando agua/ACN (20:80, v/v) o agua/ACN (30:70, v/v) acidificado a pH 3 utilizando ácido trifluoroacético (TFA). Cuando la acidificación se realizó con ácido acético (AA) al 1% (v/v), una mezcla que contenía sólo un 30% de ACN fue eficaz para la elución. Por el contrario, la elución del pentaclorofenol, que tiene una mayor afinidad por los PAbs que el triclorofenol, fue imposible con ACN puro o ACN acidificado por TFA. La desorción sólo pudo lograrse con agua/ACN 20:80 (v/v) que contenía un 1% de AA (v/v).

Por lo tanto, en la mayoría de los procedimientos fuera de línea, incluidos los recomendados utilizando IS comerciales de un solo uso, la desorción se logra con un alto porcentaje de un disolvente orgánico, a veces con un pH bajo.

En conclusión, la elección de las condiciones de elución depende en primer lugar de la afinidad entre los anticuerpos y los analitos. También depende de la naturaleza del analito, debido a la relación entre las interacciones electrónicas e hidrofóbicas implicadas en las interacciones antígeno-anticuerpo. Por último, depende de la estrategia de inmovilización de los anticuerpos; la unión no covalente evita el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos.