Ensayo de invasión

Materiales:

Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos Falcon

Inserto de cultivo celular Falcon:Tamaño de poro de 8μm, formato de 24 pocillos

Cat# 3097

Matrigel (diluido enDMEM/F12)

5% de Glutaraldehído en 1XPBS

0.5% de azul de toluidina en 2% de Na2CO3

Preparación de la cámara de Boyden:

1. Usando unas pinzas estériles, sacar los insertos de pared celular de su envase y colocarlos en los pocillos de una placa de 24 pocillos.
2. Lavar los insertos 2 veces con 300μl de DMEM/F12

(con cuidado de no apuñalar la membrana)

1. Añadir 20μl de Matrigel diluido 1:6 (2-3 mg/ml de proteína) en el centro de cada uno de los pocillos de células. Extender suavemente el Matrigel por toda la superficie de la membrana.
2. Coloque los insertos recubiertos en la incubadora para permitir que el Matrigel se solidifique durante 20-30 minutos.

Preparación de las células para el ensayo:

1. Tratar y cultivar las células según la condición experimental. Puede ser deseable sincronizar las células al mismo estado de crecimiento.
2. Tripsinización y recuento de células
3. Retirar la tripsina y resuspender con medio fresco.
4. Colocar 1X105 células en 200 μl de medio definido en la cámara superior.
5. Añadir 300 μl de medio en la cámara inferior.
6. Cultivar durante aproximadamente 20 horas.

El tiempo varía para las diferentes líneas celulares y puede ser de hasta 48 horas para las células menos invasivas.

Fijación y tinción:

1. Después del cultivo, aspirar el medio de la cámara inferior
2. Añadir 0,5 ml de Glutaraldehído al 5% en 1XPBS, incubar durante 10 min. @ R.T
3. Aspirar la solución de Glutaraldehído, lavar cada pocillo 3 veces con D.W
4. Añadir 0,5 ml de solución de tinción de Azul de Toluidina al 0,5% en la cámara inferior, incubar durante 10-20 min @ R.T
5. Aspirar la solución tanto de la cámara superior como de la inferior, lavar la cámara inferior 3 veces con D.W
6. Limpiar cuidadosamente la superficie interior de la cámara superior con un hisopo de algodón. (Tenga cuidado de no presionar demasiado, ya que la membrana podría salirse). Las células invadidas estarán en el centro del fondo de la membrana.
7. Contar el número de células con q objetivo 20X del microscopio. Contar al menos 3 campos por membrana.