Aristote enseigna à Alexandre (356-323 av. J.-C.) avant que le prince n’hérite du trône de Macédoine en 336 av. J.-C. et ne commence à étendre l’empire que son père avait gagné par la conquête. Plus tard, le jardin du Lycée d’Athènes a fini par contenir des plantes apportées par les partisans des armées d’Alexandre. Théophraste a basé nombre de ses descriptions de plantes sur les récits de voyageurs qui avaient visité les régions éloignées de l’empire d’Alexandre. La bibliothèque d’Alexandrie, que Dioscoride a probablement utilisée, a été ouverte sous le règne du général d’Alexandre, Ptolémée Ier Soter (vers 367 avant J.-C. – vers 283 avant J.-C.). Ptolémée Ier était un ami personnel proche d’Alexandre et a pu être un condisciple d’Aristote. Il est devenu le souverain de l’Égypte en 323 avant J.-C. après la mort d’Alexandre. Le travail effectif de planification et de supervision de la bibliothèque fut délégué à Démétrius de Phaléron (vers 350 – vers 280 av. J.-C.), un étudiant de Théophraste au Lycée.
Alexandre gouverna la Macédoine en tant que régent à partir de 340 av. J.-C., tandis que son père, Philippe II, dirigeait une grande armée macédonienne qui envahit la Thrace, le pays limitrophe de la Macédoine à l’est. Plus tard, Alexandre se brouilla avec Philippe et quitta la Macédoine, mais en 336 avant Jésus-Christ, Philippe fut assassiné et Alexandre, âgé de 20 ans, devint Alexandre III de Macédoine, appelé plus tard Alexandre le Grand. Lorsque la nouvelle de la mort de Philippe se répandit, les habitants des pays conquis par les Macédoniens y virent une chance de s’emparer de leur liberté, et Alexandre dut agir. Il commença par exécuter tous ses opposants à l’intérieur de la Macédoine, puis restaura la domination macédonienne en Grèce, en Thrace et en Illyrie.
Laissant un général expérimenté, Antipater (vers 398-319 av. J.-C.), maintenir l’ordre chez lui, en 334 av. J.-C., Alexandre conduisit une grande force en Asie Mineure, première étape de son expansion impériale. Les Macédoniens ont vaincu une grande armée perse, sécurisé la côte de l’Asie mineure et, en 333 avant J.-C., ils ont combattu et vaincu une autre armée perse, cette fois dirigée par le roi perse Darius III. Les forces d’Alexandre se sont ensuite dirigées vers le sud, à travers la Syrie et la Phénicie. Au printemps 331 avant J.-C., les Macédoniens sont entrés en Égypte. Après quelques mois, ils retournent à Tyr, où ils reçoivent des renforts d’Europe et se dirigent vers l’est. Ils vainquent une nouvelle fois les Perses à Gaugemala, à l’est du Tigre, occupent Babylone, puis s’emparent de Suse et de la capitale perse, Persépolis, et Alexandre est proclamé roi d’Asie. Les Macédoniens reprirent alors la poursuite de Darius, qu’ils trouvèrent mourant des blessures infligées par l’un de ses propres nobles – qui fut ensuite capturé par les Macédoniens et puni par les ordres d’Alexandre. Poussant vers l’est en Asie centrale, ils ont atteint les monts Tian Shan dans l’ouest de la Chine, où une statuette d’un soldat grec a été trouvée dans un site funéraire.
En 326 avant notre ère, Alexandre invita les chefs de ce qui est aujourd’hui le nord du Pakistan à se soumettre à son autorité. Certains acceptèrent, mais d’autres s’opposèrent aux Macédoniens et ne furent vaincus qu’après d’intenses combats au cours desquels Alexandre fut blessé. Les soldats macédoniens, qui avaient hâte de revoir leurs foyers et leurs familles, s’opposèrent au projet d’Alexandre de pénétrer plus avant en Inde et le persuadèrent de faire demi-tour. Ils atteignirent Babylone, où Alexandre mourut le 11 juin 323 avant J.-C., dans le palais de Nabuchodonosor II. Les historiens ne sont pas certains de la cause de sa mort, mais il est fort probable qu’il s’agisse d’une maladie. Dans un mois de plus, Alexandre aurait eu 33 ans. Comme le montre la carte suivante, à son apogée, son empire s’étendait de la Macédoine à l’ouest à la vallée de l’Indus à l’est, et des rives sud des mers Noire et Caspienne à l’Égypte. L’empire a commencé à se désintégrer quelques années après la mort d’Alexandre, se brisant en de nombreux royaumes indépendants.
Alexandre avait été un élève d’Aristote, et bien que l’éducation du jeune homme ait été interrompue, il était très intelligent et Aristote avait exercé une forte influence sur son développement. Aristote encourageait tous ses élèves à observer et à étudier le monde naturel, et Alexandre s’intéressait vivement aux plantes et aux animaux. Une importante suite de savants l’accompagnait lorsqu’il dirigeait ses armées. Ils mesuraient les distances, préparaient des cartes, étudiaient les religions inconnues, ainsi que la flore et la faune. Lorsqu’ils rencontraient des espèces végétales ou animales inconnues, Alexandre en renvoyait des spécimens en Europe, dont beaucoup au Lycée d’Athènes, à l’attention d’Aristote lui-même. Il recueillait les informations qu’il pouvait sur les traitements locaux à base de plantes et pratiquait la médecine, traitant personnellement certaines des blessures et des maladies dont souffraient ses soldats.
En 332 avant notre ère, Alexandre fonda la ville d’Alexandrie sur le site de Rhakotis, un port de pêche égyptien. Il voulait que la ville jette un pont entre les cultures de la Grèce et de l’Égypte, mais il n’y est resté que quelques mois après le début de la construction, et il n’est jamais revenu. Après la mort d’Alexandre, Ptolémée Ier réussit à faire transporter son corps dans la ville. La bibliothèque d’Alexandrie a été construite comme une réplique du Lyceum, avec une promenade à colonnades et des jardins. Il y avait des salles de conférence, des salles de lecture et une salle à manger commune. La bibliothèque était située à côté et au service du Musaeum, qui était un temple utilisé comme institution académique – d’où le mot musée. Les responsables de la bibliothèque avaient pour instruction de collecter toutes les informations du monde. Des représentants de la bibliothèque participaient à des foires du livre à Athènes et à Rhodes, et chaque fois qu’un navire arrivait dans le port, les livres qu’il transportait étaient saisis et copiés, la bibliothèque conservant les originaux et renvoyant les copies au capitaine du navire. C’est dans cette bibliothèque que Pedanius Dioscorides a peut-être étudié. Une grande partie de la bibliothèque a été accidentellement brûlée en 48 av. J.-C. pendant une guerre civile, et bien qu’une branche de la bibliothèque, connue sous le nom de bibliothèque fille, ait continué à fonctionner au sud de la ville, elle a également été détruite en 391 av. J.-C. lorsque l’empereur romain Théodose Ier (347-395) a ordonné la destruction de tous les temples païens.