Abstract
Contexte. L’amylose est une précipitation extracellulaire de matériel hyalin éosinophile d’origine propre avec des caractéristiques de coloration particulières et une ultrastructure fibrillaire. L’amylose maculaire est limitée à la peau, et plusieurs facteurs ont été proposés pour sa pathogenèse. La détection de l’ADN du virus Epstein-Barr (EBV) dans cette lésion suggère que ce virus peut jouer un rôle dans la pathogenèse de cette maladie. Objectif. La détection de l’ADN de l’EBV a été effectuée sur 30 échantillons de peau avec un diagnostic d’amyloïdose maculaire et 31 échantillons de peau saine dans la marge de naevus mélanocytaires enlevés en utilisant la PCR. Résultats. Chez les patients positifs pour le gène de la bêta-globine dans la PCR, le gène BLLF1 du virus EBV était positif chez 23 patients (8 patients dans le cas et 15 patients dans le groupe témoin). Il n’y avait pas de différence significative dans la présence de l’ADN EBV entre les groupes amyloïdose maculaire (3,8 %) et contrôle (23,8 %) (). Conclusion. Les résultats de cette étude ont montré que l’EBV n’est pas impliqué dans la pathogenèse de l’amyloïdose maculaire.
1. Introduction
L’amylose est le dépôt extracellulaire d’un groupe de protéines fibreuses. Il existe une variété d’approches pour la classification de l’amylose, mais la méthode la plus simple est la division en types systémiques et spécifiques aux organes (localisés). La peau est un tissu impliqué dans les deux types. L’amylose cutanée localisée est de deux types : (i) kératinique, qui peut être primaire ou secondaire, et (ii) nodulaire. Le type secondaire est secondaire à d’autres lésions cutanées telles que les tumeurs cutanées, les troubles inflammatoires de la peau et la photothérapie. Deux types d’amyloïdose kératosique ont été identifiés : l’amyloïdose maculaire et l’amyloïdose lichénique, cette dernière étant plus fréquente. Dans l’amylose kératosique, les dépôts de kératine provenant des kératinocytes basaux sont principalement positifs à la CK5. Le type kératosique est surtout observé en Asie du Sud-Est, en Amérique du Sud et en Chine. Il existe des formes familiales (10 %) et sporadiques, ces dernières étant plus fréquentes chez les femmes. Les sites d’atteinte les plus fréquents sont le haut du dos (zone interscapulaire) et les extrémités (tibias et bras), bien qu’ils aient également été décrits sur le visage, le tronc et les cuisses . Les lésions d’amylose maculaire apparaissent généralement sous la forme de taches hyperpigmentées aux marges indéfinies composées de macules brun grisâtre, ayant souvent un aspect réticulé ou ondulé (Figure 1). Les démangeaisons sont un symptôme fréquent avant l’apparition de l’amylose .
La pathogénie de cette affection n’est pas entièrement élucidée, si ce n’est que la kératine déposée provient des kératinocytes . Deux mécanismes pathogéniques ont été proposés, notamment la théorie apoptotique (fibrillaire) et la théorie sécrétoire . Selon la théorie apoptotique, la dégénérescence des kératinocytes endommagés dans la couche basale est suivie de la conversion de ces corps colloïdaux par les histiocytes dermiques et les fibroblastes en amyloïde dans le derme papillaire (figure 2). Selon la théorie sécrétoire, les dépôts d’amyloïde provenant des kératinocytes basaux dégénérés se répandent dans le derme papillaire à travers la lamina densa endommagée. Plusieurs facteurs étiologiques sont impliqués dans la pathogenèse de l’amylose maculaire : facteurs raciaux, prédisposition génétique, facteurs environnementaux, sexe (féminin), hormones féminines, exposition au soleil, friction (abrasion à long terme), atopie, auto-immunité (basée sur l’association avec le lupus érythémateux systémique, la dermatomyosite, la sclérose systémique, la sarcoïdose et la néphropathie à IgA) et infection par le virus EBV. L’EBV, dont la présence a été rapportée dans l’épiderme de l’amyloïdose maculaire, est susceptible d’agir comme un facteur contribuant à la dégénérescence des kératinocytes .
Le rôle de l’EBV dans l’étiopathogénie de l’amylose cutanée primaire n’a été évalué que dans deux études antérieures, dont un seul rapport de cas et une série de cas de 27 patients de Chine . Compte tenu du manque d’études sur l’association entre l’EBV et l’amylose maculaire, nous avons entrepris de réaliser une étude à cet égard en Iran. Peut-être que des agents antiviraux peuvent être utilisés à l’avenir pour le traitement de cette maladie en cas d’association avec l’EBV.
2. Matériaux et méthodes
Dans cette étude cas-témoins, 38 échantillons d’amyloïdose maculaire et 38 échantillons de peau saine autour de nævus mélanocytaires excisés provenant de patients appariés en âge et en sexe sans amyloïdose maculaire ont été inscrits à l’examen clinique sur la base d’un échantillonnage non aléatoire orienté vers l’objectif. Les critères d’inclusion comprenaient des blocs de paraffine avec suffisamment de tissu dans les archives du département de pathologie de l’hôpital Imam Reza de Mashhad diagnostiqués avec une amylose maculaire sur la base du rapport pathologique et de la présentation clinique. Les critères d’exclusion comprenaient les blocs avec des données imparfaites dans les archives et des échantillons insuffisants pour la PCR.
Dans le groupe de cas, le dépôt amyloïde a été confirmé par microscopie optique et coloration rouge Congo. Dans l’étape suivante, six sections de 5 μm ont été préparées à partir de chacun des blocs des groupes de cas et de contrôle dans des conditions stériles en utilisant une lame stérile et ont été placées dans des tubes Eppendorf stériles.
2.1. Déparaffinisation
Le xylol/éthanol a été utilisé pour déparaffiner les tissus paraffinés. Un ml de xylol a été ajouté aux microtubes contenant les sections de tissus et incubé à température ambiante pendant une demi-heure avec une agitation constante. Dans l’étape suivante, les microtubes ont été centrifugés à 13 000 rpm pendant 10 minutes, et leur surnageant a été jeté. Ces deux étapes ont été répétées une fois. Cinq cents μL d’éthanol à 100% ont été ajoutés au précipité et centrifugés pendant 10 m à 13 000 rpm après plusieurs inversions de microtube, puis le surnageant a été éliminé. Cette étape a été répétée à nouveau. Enfin, le précipité obtenu a été placé à température ambiante pour évaporer complètement l’éthanol mais pas le précipité.
2.2. Extraction de l’ADN
L’extraction de l’ADN a été réalisée à l’aide du kit BIO BASIC INC (Canada) dont le numéro de lot est 8401-140116. Le tampon de lyse-T a été utilisé pour l’extraction. Dans l’étape suivante, 100 μL de tampon d’extraction et 10 μL de protéinase K ont été ajoutés à chaque microtube et ont été mélangés. Les échantillons de tissus ont été ajoutés au mélange et incubés à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, les échantillons ont été incubés à 95°C pendant 3 minutes pour inactiver la protéinase K. Cent μL de tampon universel NST ont été ajoutés aux tubes et inversés 10 fois. Le mélange obtenu a été utilisé pour la PCR.
2.3. PCR
Dans cette étude, la PCR a été utilisée pour détecter la présence du génome EBV dans l’amyloïdose maculaire. Après extraction de l’ADN des blocs paraffinés, la qualité de l’ADN extrait des tissus inclus en paraffine a été déterminée à l’aide d’amorces du gène de la bêta-globine. Les amorces du gène de la bêta-globine GH20 et PC04 utilisées dans cette étude ont amplifié un fragment de 260 pb. La séquence de ces amorces était la suivante : GH20 : 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04 : 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.Les échantillons produisant le fragment de 260 pb en utilisant les amorces souhaitées ont été considérés comme favorables pour l’amplification du gène BLLF1 du virus EBV.
La présence de la séquence EBV dans les échantillons d’ADN extraits a été testée en utilisant le kit Cinna Gen avec le numéro de lot 935701 (Sina Clon, Iran). Ce kit a été conçu pour déterminer la qualité de l’ADN EBV dans les échantillons infectés en utilisant la PCR. Le réactif utilisé pour le mélange était le 1x PCR optimisé, un mélange d’ADN polymérase Taq recombinante, de tampon PCR, de MgCl2, de dNTP et d’amorces. La région hautement spécifique et répétitive du gène BLLF1 codant pour la gp 350/220 est amplifiée par les amorces. Elles peuvent détecter au moins 30 copies d’EBV. La présence de fragments de 239 pb ou 256 pb indique un résultat positif du test.
L’analyse des données a été réalisée à l’aide du logiciel SPSS 11.5. Des graphiques et des tableaux statistiques ont été utilisés pour décrire les données et des tests de Chi-carré et des -tests indépendants ont été utilisés pour comparer l’EBV dans les échantillons sains et ceux des patients. Dans tous les tests, le niveau de signification de 0,05 a été considéré.
3. Résultats
Cinquante pour cent des patients étaient des hommes (19/38) et 50% étaient des femmes (19/38). Trois patients étaient dans la tranche d’âge de moins de 20 ans (7,9%), 5 patients de 20 à 30 ans (13,2%), 10 patients de 30 à 40 ans (26,3%), 13 patients de 40 à 50 ans (34,2%), 4 patients de 50 à 60 ans (10,5%) et 3 patients de plus de 60 ans (7,9%). Les âges minimum et maximum étaient respectivement de 19 et 76 ans. Il y a eu 27 cas d’infection dans le tronc (71,1%) et 11 cas dans les extrémités (28,9%). Le groupe d’étude et le groupe témoin étaient appariés pour l’âge () et le sexe ().
La PCR a été réalisée pour le gène de la bêta-globine dans 76 échantillons (38 cas et 38 témoins), qui était positif dans 61 échantillons (30 échantillons dans le groupe de cas et 31 dans le groupe témoin) et était négatif dans 15 échantillons (8 échantillons dans le groupe de cas et 7 dans le groupe témoin) (Figure 3).
Dans 61 échantillons positifs pour le gène de la bêta-globine en PCR, le gène BLLF1 de l’EBV était positif dans 23 cas (8 cas dans le groupe d’étude et 15 cas dans le groupe de contrôle) et était négatif dans 38 cas (22 cas dans le groupe d’étude et 16 cas dans le groupe de contrôle) (Figure 4).
La PCR du gène BLLF1 de l’EBV était positive à 26,7% dans le groupe d’étude et à 48,4% dans le groupe de contrôle. Les résultats du test du chi carré n’ont montré aucune corrélation entre l’EBV et l’amyloïdose maculaire () (Tableau 1).
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4. Discussion
L’amylose est connue comme un dépôt extracellulaire de matériel hyalin éosinophile d’origine propre avec des colorations et des caractéristiques ultrastructurales spécifiques. Ce trouble peut survenir dans le contexte de maladies systémiques ou peut être limité à la peau. L’amyloïdose maculaire est limitée à la peau. L’EBV peut stimuler la sécrétion de matériel amyloïde par les kératinocytes ou peut être un stimulus pour la dégénérescence des kératinocytes et la conversion des filaments de kératinocytes dégénérés en amyloïde. Des études récentes ont indiqué le rôle des cellules épithéliales dans la reproduction continue de l’EBV. Les récepteurs de surface cellulaire de l’EBV trouvés dans l’épithélium pavimenteux moins différencié suggèrent l’infection directe des kératinocytes épidermiques. L’infection peut se produire dans les couches germinatives ; cependant, la réplication du virus n’est possible que par la maturation et la différenciation des cellules. L’expression de la cytokératine dans les kératinocytes humains est modifiée in vitro après une infection par l’EBV, ce qui entraîne leur transformation en fibroblastes . Les fibroblastes peuvent phagocyter les agrégats de kératine et les convertir en amyloïde.
Drago et al. ont montré cette corrélation en Italie en 1996. Leur patient était une femme de 30 ans avec une histoire de dix ans de papules et de macules brunes démangeantes sur la poitrine et le dos avec des symptômes de syndrome de fatigue chronique. Ils ont pu mettre en évidence le génome EBV dans les lésions épidermiques en utilisant la technique d’hybridation in situ. Le génome EBV était principalement montré dans les cellules basales de l’épiderme ainsi que dans les cellules des couches supérieures, surtout dans le cytoplasme. Les tests sérologiques pour l’EBV étaient également positifs chez le patient. Un traitement antiviral à base d’acyclovir et d’interféron alpha a amélioré les lésions cutanées et les symptômes généraux du patient. Une autre étude a été menée par Chang et al. sur le tissu cutané de 27 patients ayant reçu un diagnostic de lichen et d’amyloïdose maculaire à Taiwan en 1997. La méthode d’hybridation in situ a révélé la présence d’ADN d’EBV dans les lésions de 11 patients (40,7 %), tandis que le groupe témoin (comprenant trois patients atteints d’amylose cutanée secondaire, deux patients atteints d’amylose systémique primaire et quatre patients atteints de lichen simplex chronique) ne présentait pas d’ADN d’EBV.
Selon cette étude, il n’y avait pas de corrélation entre l’EBV et l’amylose maculaire (). L’ADN de l’EBV était présent chez 8 patients atteints d’amylose maculaire et 15 témoins dans notre étude. La différence de taux de détection de l’ADN de l’EBV entre les patients atteints d’amylose maculaire et les contrôles dans cette étude par rapport aux études mentionnées peut être due aux raisons suivantes :(1) Absence d’association entre l’amylose maculaire et l’infection par l’EBV : il existe quelques études présentant des preuves insuffisantes pour une corrélation définitive entre l’EBV et l’amylose maculaire, donc sur la base des résultats de notre étude, nous avons pu tirer cette conclusion.(2) Méthodologie (PCR contre hybridation in situ) : nous avons utilisé une méthode sensible pour la détection de l’ADN de l’EBV avec des contrôles positifs et négatifs. D’après les études précédentes, la PCR est aussi sensible que l’hybridation in situ. Cependant, comme nous n’avons pas utilisé l’hybridation in situ, nous n’avons pas pu localiser la cellule exacte infectée par l’EBV dans nos contrôles, qui pourrait être les cellules B circulantes de la peau au lieu des kératinocytes. Comme nous avons utilisé des contrôles positifs et négatifs dans notre kit PCR pour l’EBV, les cas positifs dans notre groupe de contrôle ne pouvaient pas être des faux positifs.(3)Contrôles : les contrôles dans notre étude étaient la peau saine autour des naevus mélanocytaires, mais les contrôles dans l’étude de Chang étaient d’autres troubles cutanés.(4)Type d’amyloïdose cutanée : dans notre étude, tous les patients avaient une amyloïdose maculaire, mais dans les deux études précédentes, la plupart des patients étaient de l’amyloïdose lichénique.
5. Conclusion
Selon les résultats de cette étude, il n’y a pas de corrélation entre l’EBV et l’amyloïdose maculaire. Nous recommandons l’utilisation de tissu frais ou de punch de biopsie rapidement congelé ainsi que l’étude sérologique simultanée des patients pour les anticorps anti-EBV afin d’obtenir des résultats plus précis pour l’étude comparative de l’ADN de l’EBV dans l’amylose maculaire. La PCR in situ peut également être utilisée pour localiser les cellules positives à l’ADN EBV dans les échantillons. D’autres gènes peuvent être utilisés pour détecter l’EBV dans le tissu puisque certains échantillons d’EBV sont mutés pour le gène BLLF1 utilisé dans cette étude .
De plus, nous recommandons de réaliser une étude comparative sur la détection de l’EBV dans la peau impliquée et non impliquée des patients atteints d’amylose maculaire.
Conflit d’intérêts
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Reconnaissance
Les auteurs expriment leur profonde gratitude pour le député de recherche de MUMS pour le soutien financier et l’approbation de la proposition de recherche (no 911283) liée à la thèse de Narges Nazeri. Le soutien financier de l’adjoint de recherche de l’Université des sciences médicales de Mashhad est reconnu.