I.U.B. : 3.4.21.1
C.A.S. : 9004-07-3

Réaction enzymatique (l’image s’ouvrira dans une nouvelle fenêtre)

La chymotrypsine est une sérine endopeptidase produite par les cellules acineuses du pancréas. La chymotrypsine est activée après la protéolyse du chymotrypsinogène par la trypsine. Alors que la trypsine hydrolyse la lysine et l’arginine, la chymotrypsine clive sélectivement les liaisons peptidiques formées par les résidus aromatiques (tyrosine, phénylalanine et tryptophane) (Hedstrom et al. 1992). Deux formes prédominantes de chymotrypsine, A et B, sont présentes en quantités égales dans le pancréas des bovins. Ce sont des protéines très similaires (80% identiques), mais qui ont des caractéristiques protéolytiques significativement différentes (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, et Gráf et al. 2004). Les informations ci-dessous concernent principalement la forme A du chymotrypsinogène et de la chymotrypsine.

Histoire:

Au début des années 1900, Vernon a proposé que les préparations pancréatiques puissent donner naissance à un activateur intrinsèque de ses propres enzymes (Vernon 1901). Les expériences de coagulation du lait de Vernon ont déterminé qu’il y avait au moins deux enzymes présentes et que l’une était plus stable que l’autre (Vernon 1902). Cependant, cette idée n’a pas été largement acceptée avant 1934, lorsque Kunitz et Northrop ont confirmé la présence d’une enzyme en plus de la trypsine, la nommant chymotrypsine. Ils ont réussi à cristalliser la chymotrypsine, ainsi que son précurseur inactif, le chymotrypsinogène (Kunitz et Northrop 1934). En 1938, Kunitz a isolé différentes formes actives de la chymotrypsine, les désignant comme alpha, bêta et gamma (Kunitz 1938).

Au début des années 1940, Fruton et Bergmann ont étudié plus avant la spécificité de la chymotrypsine, rapportant plusieurs nouveaux substrats (Fruton et Bergmann 1942). Jacobsen a rapidement identifié d’autres formes de chymotrypsine, les désignant comme delta et pi (Jacobsen 1947). En 1948, Schwert a encore caractérisé les poids moléculaires de la chymotrypsine et du chymotrypsinogène.

En 1954, la première preuve du mécanisme en trois étapes de la chymotrypsine hydrolysant les substrats amides et esters a été rapportée par Hartley et Kilby, qui ont émis l’hypothèse de la présence d’un intermédiaire acylique enzymatique, ce qui s’est avéré vrai par la suite (Henderson 1970). En 1955, Laskowski a obtenu un deuxième chymotrypsinogène cristallin, qu’il a nommé chymotrypsinogène B. En 1964, Hartley a déterminé la séquence d’acides aminés de la chymotrypsine A, qui a ensuite été affinée par Meloun et al. en 1966. En 1968, Smillie et al. ont déterminé la séquence d’acides aminés de la chymotrypsine B, qui a révélé une identité de séquence de 80 % avec la chymotrypsine A. Tout au long des années 1970 et 1980, des recherches ont été menées pour mieux comprendre le mécanisme d’action et identifier les différences dans les séquences d’acides aminés entre la trypsine et la chymotrypsine (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth et Polgár 1983, et Gráf et al. 1988).

Dans les années 1990, la chymotrypsine a été purifiée à partir d’autres sources, notamment la morue de l’Atlantique (Ásgeirsson et Bjarnason 1991), et le chameau (Al-Ajlan et Bailey 1997). On a également commencé à étudier les inhibiteurs (Baek et al. 1990), et Frigerio et al. ont élucidé la structure cristalline de la chymotrypsine bovine à une résolution de 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Des recherches récentes ont étudié le repliement et la dénaturation de la chymotrypsine sur une gamme de concentrations (Ghaouar et al. 2010), l’interaction de la chymotrypsine avec des substrats de nanoparticules (You et al. 2006, et Jordan et al. 2009), et l’augmentation de la stabilité de la chymotrypsine en la conjuguant à des molécules de PEG (Castellanos et al. 2005, et Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Spécificité :

La chymotrypsine est activée par le clivage de la liaison entre l’arginine et l’isoleucine (R15 et I16) par la trypsine, entraînant des modifications structurelles et la formation du site de liaison du substrat (Sears 2010). La chymotrypsine diffère de la trypsine en ce que cette dernière clive les peptides au niveau des résidus d’arginine et de lysine, tandis que la chymotrypsine préfère les grands résidus hydrophobes (Hedstrom et al. 1992). La chymotrypsine catalyse préférentiellement l’hydrolyse des liaisons peptidiques impliquant les isomères L de la tyrosine, de la phénylalanine et du tryptophane. Elle agit également facilement sur les amides et les esters des acides aminés sensibles. La spécificité de la chymotrypsine pour les grands résidus hydrophobes peut être expliquée par un pocked de liaison hydrophobe S1 formé par les résidus 189 à 195, 214 à 220, et 225 à 228 (Cohen et al. 1981).

Bien que la structure du site S1 de la trypsine et de la chymotrypsine ne présente qu’une seule différence (en position 189), la mutagenèse dirigée vers le site de la trypsine et de la chymotrypsine n’a pas permis d’échanger les spécificités, ce qui suggère que le mécanisme par lequel la trypsine et la chymotrypsine réalisent une catalyse spécifique du substrat n’est pas entièrement compris (Steitz et al. 1969, et Gráf et al. 1988).

Caractéristiques moléculaires:

Les chymotrypsines A et B partagent 80% d’identité de séquence (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, et Gráf et al. 2004). Les acides aminés de la triade catalytique (H57, D102, et S195) sont hautement conservés dans les séquences des peptidases de la famille S1 (Gráf et al. 2004). La sérine en position 214 est également très conservée dans la famille et a été proposée comme le quatrième membre de la triade catalytique (Ohara et al. 1989, et McGrath et al. 1992).

Composition:

Les trois résidus d’acides aminés de la triade catalytique (H57, D102, et S195) sont essentiels pour le clivage de la liaison peptidique et sont stabilisés par des liaisons hydrogène (Sears 2010, et Gráf et al. 2004). G193 et S195 constituent le trou d’oxyanion et interagissent avec le groupe carbonyle de la liaison peptidique scissile, l’orientant pour former l’intermédiaire tétraédrique (Rühlmann et al. 1973, Huber et Bode 1978, et Gráf et al. 2004).

Numéro d’accession des protéines : P00766

Classification CATH (v. 3.3.0):

• Classe : Principalement Bêta
• Architecture : Baril bêta
• Topologie : Sérine protéase de type trypsine

Poids moléculaire:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

Ph optimal : 7,8-8,0 (Rick 1974)

Point isoélectrique:

• 8.52 (Chymotrypsinogène, Théorique)
• 8,33 (Chymotrypsine, Théorique)

Coefficient d’extinction:

• 51,840 cm-1 M-1 (Théorique)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogène, Théorique)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsine, Théorique)

Résidus du site actif :

• Histidine (H57)
• Aspartate (D102)
• Sérine (S195)

Activateurs:

• Bromure de cétyltributylammonium (Spreti et al. 2008)
• Bromure de dodécyltriméthylammonium (Abuin et al. 2005)
• Bromure d’hexadécyltriméthylammonium (Celej et al. 2004)
• Bromure de tétrabutylammonium (Spreti et al. 2001)

Inhibiteurs :

• Hydroxyméthylpyrroles (Abell et Nabbs 2001)
• Acides boroniques (Smoum et al. 2003)
• Dérivés de la courmarine (Pochet et al. 2000)
• Peptidylaldéhydes (Lesner et al. 2009)
• Peptides de sources naturelles (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, et Chopin et al. 2000)
• Peptides contenant un acide aminé non naturel (Legowska et al. 2009, et Wysocka et al. 2008)

Applications:

• Analyse de séquences
• Synthèse de peptides
• Cartographie de peptides
• Empreinte de peptides

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