Le clonage moléculaire est un ensemble de techniques utilisées pour insérer de l’ADN recombinant provenant d’une source procaryote ou eucaryote dans un véhicule de réplication tel que les plasmides ou les vecteurs viraux. Le clonage consiste à faire de nombreuses copies d’un fragment d’ADN d’intérêt, tel qu’un gène. Dans cette vidéo, vous découvrirez les différentes étapes du clonage moléculaire, comment mettre en place la procédure et les différentes applications de cette technique.
Avant de commencer le clonage, il faut au moins deux molécules d’ADN importantes. Tout d’abord, et c’est le plus important, vous avez besoin du fragment d’ADN que vous allez cloner, autrement appelé l’insert. Il peut provenir d’un procaryote, d’un eucaryote, d’un organisme éteint, ou être créé artificiellement en laboratoire. En utilisant le clonage moléculaire, nous pouvons en apprendre davantage sur la fonction d’un gène particulier.
Deuxièmement, vous avez besoin d’un vecteur. Un vecteur est un ADN plasmidique utilisé comme outil en biologie moléculaire pour faire plus de copies ou produire une protéine à partir d’un certain gène. Les plasmides sont un exemple de vecteur, et sont des ADN circulaires, extra chromosomiques, qui sont répliqués par les bactéries.
Un plasmide possède généralement un site de clonage multiple ou MCS, cette zone contient des sites de reconnaissance pour différentes endonucléases de restriction également connues sous le nom d’enzymes de restriction. Différents inserts peuvent être incorporés dans le plasmide par une technique appelée ligature. Le vecteur plasmidique contient également une origine de réplication, ce qui lui permet d’être répliqué dans les bactéries. En outre, le plasmide possède un gène antibiotique. Si une bactérie incorpore le plasmide, elle survivra dans un milieu qui contient l’antibiotique. Cela permet de sélectionner les bactéries qui ont été transformées avec succès.
L’insert et le vecteur sont clonés dans un organisme cellulaire hôte, le plus utilisé dans le clonage moléculaire est E. coli. E. coli se développe rapidement, est largement disponible et a de nombreux vecteurs de clonage différents produits commercialement. Les eucaryotes, comme, la levure peuvent également être utilisés comme organismes hôtes pour les vecteurs.
La première étape de la procédure générale de clonage moléculaire consiste à obtenir l’insert désiré, qui peut être dérivé de l’ADN ou de l’ARNm de tout type de cellule. Le vecteur optimal et son organisme hôte sont ensuite choisis en fonction du type d’insert et de ce qui sera finalement fait avec lui. Une réaction en chaîne par polymérase, ou méthode basée sur la PCR, est souvent utilisée pour répliquer l’insert.
Puis, en utilisant une série de réactions enzymatiques, l’insert et le digest sont réunis et introduits dans l’organisme hôte pour une réplication massive. Les vecteurs répliqués sont purifiés à partir de bactéries, et après une digestion de restriction, analysés sur un gel. Les fragments purifiés sur gel sont plus tard envoyés pour le séquençage afin de vérifier que l’encart est le fragment d’ADN désiré.
Regardons un peu plus en détail comment le clonage moléculaire est mené. Avant de commencer, vous voudrez planifier votre stratégie de clonage, avant de faire toute tentative de clonage à la paillasse. Par exemple, un vecteur plasmidique donné vous fournira un nombre limité de sites de restriction pour incorporer l’insert via le site de clonage multiple. Vous devrez choisir des sites de restriction qui ne se trouvent pas dans votre insert afin de ne pas le cliver. Vous pouvez vous retrouver dans une situation où vous êtes obligé de joindre un fragment à extrémité émoussée avec un fragment qui a un surplomb. Si tel est le cas, l’utilisation du fragment klenow pour mettre en place une ligature à extrémité émoussée pourrait être votre seule option pour obtenir l’insert dans le vecteur souhaité. La compréhension des différents outils de clonage moléculaire à votre disposition, ainsi que la mise en place d’une stratégie minutieuse avant de commencer le clonage peuvent constituer un immense gain de temps.
La source d’ADN pour le clonage moléculaire peut être isolée à partir de presque n’importe quel type de cellule ou d’échantillon de tissu grâce à des techniques d’extraction simples. Une fois isolé, la PCR peut être utilisée pour amplifier l’insert.
Une fois que l’insert est amplifié, à la fois lui et le vecteur sont digérés par des enzymes de restriction, également connues sous le nom d’endonucléases de restriction.
Une fois digérés, l’insert et le vecteur peuvent être passés sur un gel et purifiés par un processus appelé purification sur gel. En ce qui concerne le vecteur, cette étape aidera à purifier le plasmide linéarisé du plasmide non coupé, qui a tendance à apparaître comme un frottis de poids moléculaire élevé sur un gel.
Après avoir purifié les digests sur gel, l’insert est ligaturé ou joint au plasmide, via une enzyme appelée ADN ligase.
Généralement, c’est toujours une bonne idée de mettre en place des ligations, de sorte que le rapport entre l’insert et le vecteur soit de 3 à 1, ce qui garantit que seule une petite quantité de vecteur s’auto-ligaturera. Une fois que la ligature a été mise en place sur la glace, elle est incubée n’importe où entre 14-25˚C de 1 h à une nuit.
Puis, la transformation est effectuée pour introduire le vecteur plasmidique dans l’hôte qui le répliquera.
Après transformation, les bactéries sont plaquées sur des plaques de gélose avec antibiotique et incubées pendant la nuit à 37°C. Comme le plasimide contient un gène de résistance aux antibiotiques, une transformation réussie produira des colonies bactériennes lorsqu’elles seront cultivées sur des plaques de gélose en présence d’antibiotiques. Les colonies individuelles peuvent alors être prélevées sur la plaque transformée, placées dans des milieux de croissance liquides dans des tubes numérotés, et placées dans un incubateur à secousses pour l’expansion. Un petit volume de culture liquide est ajouté à une plaque de gélose numérotée, tandis que le reste de la culture passe à la purification des plasmides. Le schéma de numérotation qui dénote l’identité des colonies bactériennes à partir desquelles les plasmides seront finalement purifiés est maintenu tout au long du processus de purification des plasmides.
Un échantillon de plasmide purifié est ensuite coupé avec des enzymes de restriction. Le digest est ensuite chargé et passé sur le gel afin de vérifier la présence d’insert, ce qui permettra de vérifier que la colonie bactérienne a été transformée avec un plasmide contenant un insert et non un plasmide auto-ligaturé. Les bactéries dont on a vérifié qu’elles ont été transformées avec un plasmide contenant un insert, sont expansées pour une purification supplémentaire du plasmide. Le séquençage est utilisé effectué comme une étape de vérification finale pour confirmer que votre gène d’intérêt a été cloné.
Le clonage moléculaire peut être utilisé pour un nombre presque illimité d’applications. Par exemple, lorsqu’un modèle d’ARNm est transcrit de manière inverse pour former de l’ADNc, ou ADN complémentaire, par une enzyme appelée transcriptase inverse, puis que la PCR est utilisée pour amplifier l’ADNc, le clonage moléculaire peut être utilisé pour créer une bibliothèque d’ADNc – une bibliothèque de tous les gènes exprimés par un type de cellule donné.
Le clonage moléculaire peut également être employé pour prendre une série de gènes, ou un groupe de gènes d’une souche bactérienne, les réorganiser en plasmides qui sont transformés dans une autre souche, ainsi une voie biosynthétique entière peut être recréée pour produire une molécule complexe.
Par clonage moléculaire, une bibliothèque de mutants peut être générée en exprimant un plasmide cible dans une souche bactérienne spéciale qui utilise une polymérase sujette aux erreurs lorsqu’elle est cultivée à certaines températures. Les mutations peuvent être caractérisées par séquençage. Les bactéries transformées avec des gènes mutants peuvent ensuite être testées avec différents médicaments ou produits chimiques pour voir quelles colonies bactériennes ont évolué vers une résistance aux médicaments.
Grâce au clonage moléculaire, des gènes rapporteurs peuvent être incorporés dans des plasmides d’ADN, un gène rapporteur commun est la protéine fluorescente verte ou GFP, qui émet une fluorescence verte lorsqu’elle est exposée à la lumière UV. Un gène rapporteur peut également être inséré dans un alphavirus pour montrer l’infection chez les moustiques et la transmissibilité dans les cellules.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le clonage moléculaire. Vous devriez maintenant comprendre comment fonctionne le clonage moléculaire et comment cette technique peut être utilisée en biologie moléculaire. Comme toujours, merci d’avoir regardé!