2.19.2.3.3 Conditions d’élution
Des solutions d’élution efficaces devraient idéalement perturber les interactions analyte-anticorps sans affecter négativement les Abs immobilisées. Un déplaceur est une molécule à réaction croisée hautement concentrée capable d’induire une désorption biospécifique. Les molécules du déplaceur entrent en compétition avec les molécules de l’analyte lié, et l’excès important de déplaceur assure une désorption quantitative de l’analyte. Pour une performance optimale, le déplaceur doit répondre à plusieurs critères : (1) une réactivité croisée élevée avec les anticorps immobilisés, (2) un temps de rétention significativement différent de celui des analytes car le grand excès provoque un pic proéminent qui peut facilement interférer avec la détection des analytes, (3) une bonne stabilité et une grande pureté car les impuretés présentes à des niveaux aussi bas que 0,01-0,1% peuvent perturber le chromatogramme, et (4) un faible prix, des caractéristiques non toxiques, une absence dans les échantillons réels et une faible détectabilité par rapport aux analytes. De plus, un grand volume de solution d’élution est nécessaire, ce qui impose une reconcentration sur un support SPE classique avant analyse. Par conséquent, les conditions d’élution permettant la récupération complète de l’analyte cible avec un petit volume d’élution sont préférées.
Les ions chaotiques sont couramment utilisés pour l’élution de grosses molécules telles que les protéines. Ces ions perturbent la structure de l’eau autour des grandes molécules, c’est-à-dire les anticorps et les molécules cibles, ce qui induit une rupture des interactions hydrophobes dans les structures des grandes molécules et entre l’analyte et l’anticorps. Les ions chaotropes les plus courants sont les ions chlorure, iodure, perchlorate et thiocyanate, à des concentrations comprises entre 1,5 et 8 mol l-1. Cependant, les diverses solutions aqueuses qui peuvent être appliquées avec succès pour la désorption des protéines des IS se sont révélées incapables de désorber les petites molécules. La désorption de la protéine est probablement basée principalement sur les changements de la structure de la protéine liée (dénaturation partielle), et non sur les changements de la structure des anticorps immobilisés. Par conséquent, l’élution des petites molécules, qui ne sont pas sensibles à la dénaturation, nécessite des conditions beaucoup plus rigoureuses. De plus, avec une augmentation de la température de 4 à 43 °C, la constante de dissociation des interactions anticorps-analyte peut être augmentée de deux ordres de grandeur. Cette méthode n’est pas suffisamment efficace pour être appliquée à l’élution de petites molécules. L’élution avec des solutions à faible pH est souvent effectuée pour désorber les petites molécules des IS, mais trois unités de pH du point isoélectrique de l’anticorps sont nécessaires. Ce type d’élution (déplacement du pH sans modification de la force ionique) évite d’endommager les anticorps labiles. Un inconvénient est que de grands volumes sont encore nécessaires pour une désorption complète, diminuant ainsi les facteurs d’enrichissement associés aux procédures d’extraction.
Une élution efficace des petites molécules à partir d’un IS peut être obtenue avec un volume réduit d’un mélange eau-modificateur organique. A titre d’exemple, la figure 6 présente le profil d’élution de deux herbicides, l’isoproturon et l’atrazine, après la percolation d’un échantillon d’eau dopé avec chaque analyte sur son IS correspondant. Plusieurs solvants d’élution (méthanol, éthanol et ACN) mélangés à l’eau ont été évalués.
Figure 6. Profils d’élution de l’atrazine, de l’isoproturon, du 2,4,6-trichlorophénol et du pentachlorophénol à partir de leur IS correspondant en utilisant des solutions d’élution contenant des quantités croissantes d’un solvant organique dans de l’eau acidifiée ou non acidifiée après la percolation d’échantillons d’eau dopés de chaque analyte. ACN, acétonitrile ; MeOH, méthanol ; EtOH, éthanol ; AA, acide acétique ; TFA, acide trifluoroacétique.
Les profils d’élution obtenus dépendent fortement de la nature du solvant. Les trois solvants testés permettent l’élution complète des deux analytes. Cependant, l’ACN présente la force d’élution la plus élevée : la plus faible teneur de ce solvant permet une élution complète des deux analytes. Une teneur en ACN de 40 % et 60 % est suffisante pour récupérer l’isoproturon et l’atrazine, respectivement, alors que 60 % et 80 % de méthanol sont nécessaires. Dans ce cas, la force d’élution du solvant semble être liée à sa nature hydrophobe, l’ACN (paramètre de solubilité de Hildebrand δ = 24,3 MPa1/2) étant moins polaire que l’éthanol (δ = 26,0 MPa1/2) et le méthanol (δ = 29,7 MPa1/2). Ces résultats semblent indiquer que les interactions entre les herbicides et leurs anticorps correspondants sont principalement de nature hydrophobe. La présence de solvants non polaires réduit la composante de liaison hydrophobe de l’interaction anticorps-analyte. Cependant, elle affecte également la stabilité des liaisons hydrophobes, maintenant la structure tertiaire de l’anticorps, et entraîne la libération de l’antigène. Ces exemples relatifs à l’élution de l’atrazine ou de l’isoproturon à partir de leurs IS correspondants montrent qu’une élution efficace sera obtenue en ajoutant directement une quantité élevée de méthanol ou d’ACN, 70-80%, dans la fraction d’élution. Cette quantité élevée de modificateur organique permettra de réduire autant que possible le volume de la fraction d’élution, permettant ainsi la concentration de l’analyte dans l’éluat. Il faut veiller à ce que le choix du mode de liaison soit compatible avec ces conditions d’élution. L’utilisation d’un mode de liaison non covalent empêche la possibilité d’appliquer une quantité aussi élevée de modificateur sans risquer de perturber la liaison des anticorps du sorbant. L’utilisation d’un procédé sol-gel pour l’immobilisation des anticorps limite également la possibilité d’utiliser une grande quantité de solvant organique. Il a été démontré qu’une grande quantité de modificateur organique tel que les anticorps provoque la lixiviation des anticorps de la matrice sol-gel.8
Une combinaison de solvant organique et d’acide organique est parfois nécessaire. La figure 6 présente également le profil d’élution du 2,4,6-trichorophénol et du pentachlorophénol à partir d’un IS anti-pentachlorophénol en utilisant un mélange hydro-organique avec et sans ajout d’un acide à la solution d’élution. Le trichlorophénol a pu être complètement récupéré en utilisant soit de l’eau/ACN (20:80, v/v), soit de l’eau/ACN (30:70, v/v) acidifié à pH 3 avec de l’acide trifluoroacétique (TFA). Lorsque l’acidification a été réalisée par de l’acide acétique (AA) à 1% (v/v), un mélange contenant seulement 30% d’ACN a été efficace pour l’élution. En revanche, l’élution du pentachlorophénol, qui a une plus grande affinité pour les PAbs que le trichlorophénol, était impossible avec l’ACN pur ou l’ACN acidifié par le TFA. La désorption n’a pu être réalisée qu’avec de l’eau/ACN 20:80 (v/v) contenant 1% d’AA (v/v).
Par conséquent, dans la plupart des procédures hors ligne, y compris celles recommandées en utilisant des SI commerciaux à usage unique, la désorption est réalisée avec un pourcentage élevé d’un solvant organique, parfois à faible pH.
En conclusion, le choix des conditions d’élution dépend d’abord de l’affinité entre les anticorps et les analytes. Il dépend également de la nature de l’analyte, en raison du rapport entre les interactions électroniques et hydrophobes impliquées dans les interactions antigène-anticorps. Enfin, elle dépend de la stratégie d’immobilisation des anticorps ; la liaison non covalente évite l’utilisation de grandes quantités de solvants organiques.