Essai d’invasion

Matériels:

Plaque de culture tissulaire 24 puits Falcon

Insert de culture cellulaire Falcon :Taille des pores de 8μm, format 24 puits

Cat# 3097

Matrigel (dilué dansDMEM/F12)

5% Glutaraldéhyde dans 1XPBS

0.Bleu de Toluidine à 5% dans 2% de Na2CO3

Préparationde la chambre de Boyden:

1. À l’aide de pinces stériles, retirer les inserts de paroi cellulaire de leur emballage et les pitcher dans les puits d’une plaque à 24 puits.
2. Laver les inserts 2 fois avec 300μl de DMEM/F12

(Attention à ne pas poignarder la membrane)

1. Ajouter 20μl de Matrigel dilué 1:6 (2-3 mg/ml de protéines) au centre de chaque insert de puits de cellules. Répartir délicatement le Matrigel sur toute la surface de la membrane.
2. Placez les inserts enrobés dans l’incubateur pour permettre au Matrigel de se solidifier pendant 20-30 min.

Préparation des cellules pour le test:

1. Traiter et faire croître les cellules selon les conditions expérimentales. Il peut être souhaitable de synchroniser les cellules au même état de croissance.
2. Trypsiniser et compter les cellules
3. Retirer la trypsine et remettre en suspension avec du milieu frais.
4. Placer 1X105 cellules dans 200 μl de milieu défini dans la chambre supérieure.
5. Ajouter 300 μl de milieu chambre inférieure.
6. Culture pendant environ 20 heures.

Le temps varie pour les différentes lignées cellulaires et peut aller jusqu’à 48 heures pour les cellules moins invasives.

Fixation et coloration:

1. Après la culture, aspirer le milieu de la chambre inférieure
2. Ajouter 0,5 ml de Glutaraldéhyde à 5% dans 1XPBS, incuber pendant 10 min. @ R.T
3. Aspirer la solution de Glutaraldéhyde, laver chaque puits 3 fois avec du D.W
4. Ajouter 0,5 ml de solution de coloration au bleu de Toluidine à 0,5 % dans la chambre inférieure, incuber pendant 10-20 min @ R.T
5. Aspirer la solution de la chambre supérieure et de la chambre inférieure, laver la chambre inférieure 3 fois avec du D.W
6. Essuyer soigneusement la surface interne de la chambre supérieure à l’aide d’un coton-tige. (Attention à ne pas appuyer trop fermement, la membrane pourrait être arrachée.) Les cellules envahies seront au centre du fond de la membrane.
7. Compter le nombre de cellules avec q objectif 20X du microscope. Comptez au moins 3 champs par membrane.