Culture cellulaire, amplification et purification du virus pour les expériences SHAPE-MaP et SPLASH
Les cellules de rein de bovin Madin-Darby (MDBK) et de rein de canin Madin-Darby (MDCK) ont été cultivées dans un milieu essentiel minimum (Merck), complété par 2 mM l-glutamine et 10% FCS. Des stocks de virus WSN (H1N1) ont été produits en infectant des cellules MDBK avec le virus de la grippe à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01. Les stocks viraux des virus Udorn (H3N2) et PR8 (H1N1) (PR8) ont été produits en infectant des cellules MDCK à une MOI de 0,001 en présence de 0,8 μg ml-1 de trypsine traitée au n-Tosyl-l-phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK) (Merck). Les virus ont été collectés 2 jours après l’infection. Les virus ont été purifiés par ultracentrifugation : d’abord, le milieu de culture cellulaire infecté a été clarifié par centrifugation à 4 000 r.p.m. pendant 10 minutes à 4 °C, suivie d’une centrifugation à 10 000 r.p.m. pendant 15 minutes à 4 °C. Le virus a ensuite été purifié par centrifugation. Le virus a ensuite été purifié par centrifugation à travers un coussin de saccharose à 30 % à 25 000 tours par minute pendant 90 minutes à 4 °C dans un rotor SW 32 (Beckman Coulter). Le culot viral purifié a été remis en suspension dans un tampon de remise en suspension (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Nous notons que ni les structures tertiaires des virions ni celles de l’ARN ne sont perturbées par l’ultracentrifugation30,31,32.
SHAPE-MaP
SHAPE-MaP a été réalisé selon les procotols publiés17 ; l’anhydride 1-méthyl-7-nitroisatoïque (1M7) a été synthétisé à partir de l’anhydride 4-nitroisatoïque comme décrit précédemment33. Pour les expériences d’ARN transcrit in vitro, chaque segment d’ARN viral a été synthétisé à partir d’une matrice d’ADN linéaire à l’aide du kit de synthèse d’ARN à haut rendement HiScribe T7 (New England Biolabs). La taille et la pureté des produits ont été vérifiées sur un gel d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à 3,5 %. Les échantillons d’ARN viral nu ont été préparés en purifiant les particules WSN sur un coussin de saccharose comme décrit précédemment. Les virus purifiés ont été traités avec 250 μg ml-1 de protéinase K (Roche) dans un tampon protéinase K (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS) pendant 40 min à 37 °C. Avant la modification, les échantillons d’ARN transcrit in vitro et d’ARN viral nu ont été pliés à 37 °C pendant 30 min dans un tampon de pliage (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Du 1M7 (dissous dans du diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO ; Merck)) a été ajouté à une concentration finale de 10 mM à l’ARN replié et les échantillons ont été incubés pendant 75 s à 37 °C. Les modifications in virio ont été réalisées en ajoutant 1M7 directement au virus purifié. La capacité des réactifs SHAPE-MaP à pénétrer dans les particules virales a été initialement testée comme décrit précédemment34 en réalisant des extensions d’amorces marquées au 32P sur l’ARN extrait du virus traité par le réactif SHAPE-MaP à l’aide d’une amorce ciblant le segment NA (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′). Parallèlement aux échantillons traités au 1M7, des échantillons témoins ont été traités au DMSO. Le réactif SHAPE-MaP à l’anhydride n-méthylisatoïque (NMIA ; Thermo Fisher Scientific) a également été testé in virio. Les expériences avec NMIA ont été effectuées comme décrit pour 1M7, sauf que les virions purifiés ont été traités avec NMIA pendant 45 min.
La préparation de la bibliothèque de séquençage a été effectuée comme décrit précédemment17 selon le workflow randomer. En bref, après le traitement 1M7 ou le traitement témoin, l’ARN a été purifié à l’aide du kit RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research). L’ARN a fait l’objet d’une transcription inverse à l’aide du Random Primer Mix (New England Biolabs) avec SuperScript II (Invitrogen) dans le tampon MaP (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM dithiothreitol et 0,5 mM deoxynucléoside triphosphate). La trousse Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) a été utilisée pour préparer les bibliothèques d’ADN. Les produits d’amplification PCR finaux ont été sélectionnés par taille à l’aide de billes Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) et leur qualité a été évaluée avec le kit Agilent DNA 1000 (Agilent Technologies) sur un système Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Pour le WSN, l’ARN viral nu et l’ARN transcrit in vitro, les bibliothèques ont été séquencées (2 × 150 paires de bases (pb)) sur un système HiSeq 4000 (Illumina) ; pour les virus PR8 et Udorn, les bibliothèques ont été séquencées (1 × 150 pb) sur un système NextSeq 500 (Illumina).
SPLASH
Les échantillons de SPLASH ont été préparés comme publié précédemment24,35, avec quelques modifications, pour deux répliques de chacun des virus WSN, PR8 et Udorn et une seule réplique pour chacun des virus réassortis H3N2. Le virus purifié a été incubé avec 200 μM de EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) et 0,01 % de digitonine (Merck) pendant 5 minutes à 37 °C. Le virus a été étalé sur un plat à 6 puits, recouvert d’une plaque de verre, placé sur la glace et irradié pendant 45 min à l’aide d’une lampe UV manuelle UVP Ultra Violet Product (Thermo Fisher Scientific). Le virus réticulé a été traité à la protéinase K et l’ARN viral a été extrait à l’aide de TRIzol (Invitrogen). Une aliquote de l’ARN viral extrait a été utilisée pour détecter l’incorporation de biotine à l’aide d’un kit de module de détection d’acide nucléique chimiluminescent (Thermo Fisher Scientific) sur une membrane en nylon Hybond-N (GE Healthcare Life Sciences). Le reste de l’ARN viral extrait a été fragmenté à l’aide du module de fragmentation de l’ARN NEBNext Magnesium (New England Biolabs) et sélectionné par taille pour les fragments inférieurs à 200 nt à l’aide du kit RNA Clean & Concentrator-5. Les échantillons ont été enrichis en ARN viral biotinylé à l’aide de billes Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific) ; la ligature de proximité sur les billes et l’inversion de la liaison croisée par le psoralène ont été effectuées comme publié précédemment24,35. Les bibliothèques de séquençage ont été préparées à l’aide du kit commercial SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories). La sélection finale de la taille a été effectuée en faisant passer les bibliothèques de séquençage amplifiées par PCR sur un gel PAGE à 6 % (Thermo Fisher Scientific) dans du Tris/acide borique/EDTA (TBE), en sélectionnant un ADN de 200 à 300 pb. Les librairies ont été séquencées 1 × 150 pb sur un système NextSeq 500.
Traitement des lectures de séquençage SHAPE-MaP
Les lectures de séquençage ont été rognées pour éliminer les adaptateurs en utilisant Skewer v0.2.2 (réf. 36). Les profils de réactivité SHAPE-MaP ont été générés à l’aide du pipeline ShapeMapper2 publié37, qui aligne les lectures sur le génome de référence et calcule les taux de mutation à chaque position nucléotidique. Les taux de mutation sont ensuite convertis en valeurs de réactivité SHAPE-MaP définies comme suit :
où mutr1M7 est le taux de mutation des nucléotides dans l’échantillon traité par 1M7 et mutrDMSO est le taux de mutation dans l’échantillon traité par DMSO. Toutes les réactivités SHAPE-MaP ont été normalisées sur une échelle approximative de 0-2 en divisant les valeurs de réactivité SHAPE-MaP par la réactivité moyenne des 10 % de nucléotides les plus réactifs après exclusion des valeurs aberrantes (définies comme des nucléotides dont les valeurs de réactivité sont >1,5 de l’écart interquartile). Les réactivités SHAPE-MaP élevées indiquent des régions d’ARN plus flexibles (c’est-à-dire monocaténaires) et les réactivités SHAPE-MaP faibles indiquent des régions d’ARN plus contraintes structurellement (c’est-à-dire appariées en bases).
Traitement des lectures de séquençage SPLASH
Les lectures de séquençage ont été rognées pour éliminer les adaptateurs à l’aide de Skewer v0.2.2 (réf. 36). STAR v.2.5.3 (réf. 38) a été utilisé pour aligner les lectures sur le génome de référence du virus approprié (Tableau supplémentaire 2). Seules les lectures chimériques dont au moins 20 nt étaient alignées sur les segments de référence ont été utilisées pour la suite du traitement (paramètre STAR : -chimSegmentMin 20). Les lectures chimériques ont été dédupliquées en utilisant les chaînes CIGAR et les positions d’alignement. Les chaînes CIGAR dans chaque alignement de lecture ont été traitées pour trouver les coordonnées de début et de fin de lecture. Les coordonnées des lectures chimériques ont été utilisées pour produire une matrice d’interactions entre les séquences dans le logiciel R. Les loci discrets de la matrice ont été analysés. Des loci discrets dans la matrice ont été sélectionnés et ajustés individuellement avec une courbe gaussienne basée sur l’intensité du chevauchement des lectures pour définir une fenêtre d’interaction ; les fenêtres d’interaction de loci complexes se chevauchant ont été séparées en fenêtres individuelles. La largeur de la fenêtre d’interaction a été utilisée pour déterminer les coordonnées de début et de fin de chaque interaction ; le nombre de lectures qui se trouvaient à l’intérieur (ou partiellement à l’intérieur) de cette région a été utilisé comme mesure de la fréquence d’interaction. Pour la génération de figures, les 20 principales interactions dans chaque virus ont été visualisées à l’aide du paquet circlize v.0.4.5 (réf. 39) dans R v.3.5.1. L’ensemble complet des loci d’interaction est fourni dans le tableau supplémentaire 2. Pour la validation par qPCR des loci d’interaction, les échantillons réticulés au psoralène ont été préparés et enrichis comme décrit précédemment, mais avec un temps de fragmentation raccourci (3 contre 4 min) pour générer des fragments d’ARN plus longs. L’ARN a été polyadénylé avec la Poly(A) Polymerase (Takara Bio) et l’ADN complémentaire a été généré en utilisant l’amorce smRNA dT (Takara Bio) et la transcriptase inverse PrimeScript (Takara Bio) selon les instructions du fabricant. Une qPCR à 50 cycles a été réalisée conformément aux instructions du fabricant sur un instrument StepOnePlus (Applied Biosystems) en utilisant le mélange maître QPCR Brilliant II SYBR Green avec ROX (Agilent Technologies) et des paires d’amorces pour tester les interactions entre segments. Les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau supplémentaire 3. Après 50 cycles d’amplification par qPCR, les produits ont été résolus par PAGE à 8 % (acrylamide/bis-acrylamide 29:1, tampon TBE 1×) et visualisés par transillumination en lumière bleue.
Prédictions de structure d’ARN
L’algorithme IntaRNA v.2..3.1 (réf. 40) a été utilisé pour prédire la capacité des interactions ARN-ARN à se produire dans les régions identifiées lors de l’analyse SPLASH, en utilisant les options mode exact (-mode E) et aucune contrainte de graine (-noSeed). Les réactivités SHAPE-MaP ont été incluses dans la modélisation des interactions ARN-ARN (-tShape et -qShape). Des ensembles de données permutées ont été générés en mélangeant de manière aléatoire les partenaires d’interaction spécifiques identifiés par SPLASH et en évaluant les énergies ΔG d’interaction à l’aide d’IntaRNA. La signification de la différence entre les distributions de probabilité des énergies ΔG associées aux interactions intermoléculaires de l’ARN identifiées par SPLASH et les ensembles de données permutées a été calculée à l’aide du test de Wilcoxon rank-sum dans le logiciel R. Les prédictions de structure IntaRNA ont ensuite été utilisées pour ajuster les régions d’interaction aux nucléotides impliqués dans l’appariement de bases. Lorsque les données SHAPE-MaP n’étaient pas disponibles (réassortiments PR8 avec des virus H3N2), le pré-pliage de chaque brin d’ARN (‘accessibilité’) a été désactivé dans IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). Pour la validation par rapport aux structures connues, les données de structure secondaire de l’ARN ont été extraites de la base de données RNA3Dhub41, sur la base des structures de microscopie électronique cryogénique du ribosome 80S42 (PDB : 6EK0) et du complexe spliceosomal à triple petite ribonucléoprotéine nucléaire U4/U6.U543 (EMDB : EMD-2966). Les séquences d’ARN de référence ont été corrigées pour correspondre aux séquences bovines (MDBK) pour l’ARN ribosomal et les petits ARN nucléaires U4/U6, comme décrit précédemment44. Pour les prédictions de structure intramoléculaire de l’ARN, le paquet ViennaRNA v.2.0 (réf. 45) a été utilisé. La commande RNAfold a été utilisée pour prédire les structures secondaires de l’ARN et les fonctions de partition pour chaque segment. Les réactivités SHAPE-MaP ont été incluses comme contraintes de pseudo-énergie. Une analyse de corrélation à fenêtre médiane glissante de 50 nt entre les profils de réactivité SHAPE-MaP ex virio et in virio a été utilisée pour déterminer l’étendue de la corrélation SHAPE-MaP entre l’ARN transcrit par T7 et l’ARN associé à la vRNP. Nous avons constaté qu’il n’existait aucune corrélation >150 nt ; par conséquent, nous avons fixé la contrainte de distance d’appariement maximale pour les prédictions de structure et de fonction de partition à 150 nt. Pour les prédictions de structure intramoléculaire, nous avons fixé les nucléotides dans la région du promoteur à un seul brin.
Culture cellulaire pour l’ingénierie inverse des virus de la grippe
Les cellules MDCK et les cellules de rein embryonnaire humain (HEK 293T) proviennent d’une collection existante dans le département de microbiologie et d’immunologie de l’Université de Melbourne. Les cellules MDCK ont été cultivées dans le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich) et les cellules HEK 293T dans le milieu DMEM (Thermo Fisher Scientific). Les deux milieux ont été complétés par 10 % de FCS inactivé par la chaleur, 2 mM l-glutamine, 2 mM pyruvate de sodium, 24 μg ml-1 de gentamicine, 50 μg ml-1 de streptomycine et 50 UI ml-1 de pénicilline. Les cocultures de cellules MDCK et de cellules HEK 293T pour la transfection ont été établies dans du Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) avec 50 μg ml-1 de streptomycine et 50 UI ml-1 de pénicilline.
Construction de virus grippaux issus de la génétique inverse
Des segments de gènes individuels provenant des virus PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) et Wyo03 (H3N2) ont été transcrits de manière inverse et clonés dans des plasmides pHW200046. Les virus issus de la génétique inverse contenaient un gène PB1 PR8, Udorn, Mem71, PC73 ou Wyo03 avec un gène NA de type sauvage ou modifié dans un fond génétique comprenant six segments du virus PR8 (PB2, PA, HA, NP, M et NS). Le gène NA modifié (Wyo03UdSub) était dérivé de Wyo03 et portait 4 substitutions vers la séquence Udorn-NA : nucléotides G943A ; C938U ; U933C ; et G923A. Trois de ces quatre changements nucléotidiques étaient silencieux, le quatrième (A534G) entraînant un changement conservateur de lysine en arginine (K172R). Des fragments complémentaires incorporant ces changements ont été générés par PCR et réunis par une autre série de PCR en utilisant des amorces spécifiques du segment contenant des sites de restriction BsmBI47 ; le produit a été cloné dans le vecteur d’expression pHW2000 pour le sauvetage du virus. Les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau supplémentaire 3. Les virus sauvés ont été amplifiés dans des œufs de poule embryonnés à 10 jours. La teneur en virus du liquide allantoïque infectieux a été titrée par la formation de plaques dans des cellules MDCK48 et stockée à -80 °C.
Détermination de la cinétique de réplication virale des virus issus de l’ingénierie inverse
Les caractéristiques de réplication des virus issus de l’ingénierie inverse ont été déterminées en infectant des cellules MDCK à une MOI de 0,01. Après 1 h d’absorption (à t = 0 h), l’inoculum a été retiré et les cellules ont été lavées et incubées à 37 °C, 5 % de CO2 dans du RPMI 1640 complété par 2 mM l-glutamine, 2 mM pyruvate de sodium, 24 μg ml-1 de gentamicine, 50 μg ml-1 de streptomycine, 50 UI ml-1 de pénicilline et 1 μg ml-1 de trypsine traitée par TPCK (Worthington Biochemical Corporation). Les surnageants de culture cellulaire ont été recueillis à différents moments après l’infection et conservés à -80 °C pour analyse. Les titres viraux ont été déterminés par la formation de plaques sur des monocouches confluentes de cellules MDCK.
Rétroingénierie compétitive à neuf plasmides des virus de la grippe
La rétroingénierie compétitive des virus de la grippe a été entreprise en utilisant une version modifiée du système de génétique inverse à huit plasmides26, comme décrit précédemment25. En bref, les plasmides codant les segments d’ARN viral PB2, PB1, PA, hémagglutinine (HA), nucléoprotéine (NP), protéine de matrice (M) et protéine non structurale (NS) de PR8 ont été co-transfectés avec des plasmides codant l’ARN viral de la neuraminidase (NA) et l’ARN viral PB1 concurrent de Udorn, Mem71, PC73 ou Wyo03 de type sauvage ou modifié. Chaque plasmide (1 µg) a été mélangé au réactif de transfection FuGENE 6 (Promega) dans Opti-MEM et ajouté à une coculture de cellules HEK 293T et MDCK. Six heures après la transfection, le milieu a été remplacé par du Opti-MEM complété par 50 μg ml-1 de streptomycine et 50 UI ml-1 de pénicilline. Vingt-quatre heures plus tard, de la trypsine traitée par TPCK (1 μg ml-1) a été ajoutée et le surnageant a été collecté après 42 heures supplémentaires et stocké à -80 °C. Pour déterminer les fréquences d’incorporation des gènes PB1 concurrents, les virus de la descendance dans le surnageant de transfection ont été soumis à un test de plaque dans des cellules MDCK. Des plaques choisies au hasard (environ 36 par expérience) ont été prélevées par échantillonnage à travers l’agarose et remises en suspension dans du Triton-X100 à 0,05 %. La source des segments de gènes en compétition a été identifiée par RT-PCR quantitative spécifique aux gènes à l’aide du kit RT-PCR en une étape SensiFast probe no-ROX (Bioline). Chaque réaction de 20 μl a été réalisée en utilisant 5 μl de suspension virale prélevée par plaque, 10 μl de mélange 2× SensiFast SYBR no-ROX one-step, 0,2 μl de transcriptase inverse, 0,4 μl d’inhibiteur de RNase Ribosafe, 0,8 μl de chaque amorce directe et inverse spécifique du gène de 10 μM et 0,08 μl de chaque sonde spécifique du gène de 25 μM. Les séquences des amorces et des sondes sont indiquées dans le tableau supplémentaire 3. La réaction de RT-PCR a été incubée pendant 10 min à 45 °C, avant de procéder à l’amplification par qPCR, conformément aux instructions du fabricant. Les valeurs rapportées sont des données combinées de 3 à 8 expériences de transfection indépendantes pour chaque compétition.
Résumé du rapport
Des informations supplémentaires sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.