Abstract
Le présent travail montre qu’une description détaillée de l’ultrastructure des cellules sécrétoires des îlots pancréatiques du poisson-chat sud-américain Rhamdia quelen est présentée. Des preuves sont offertes pour soutenir l’affirmation que les α-granules sont constitués d’une partie centrale et d’une partie externe de densités électroniques et de solubilités différentes, que les cellules δ sont très probablement des cellules α morphologiquement altérées mais viables, et que les β-granules possèdent éventuellement une sous-structure répétitive et peuvent donc représenter une forme de stockage cristalline intracellulaire de l’insuline.
1. Introduction
Les îlots de Langerhans ont été découverts chez le lapin par Langerhans en 1869. Cependant, ils ont été signalés par Stannius et Blockmann chez les téléostéens environ 20 ans plus tôt et sont donc également, bien que moins fréquemment, appelés corps de Stannius ou de Blockmann. Les îlots de Langerhans sont d’origine endodermique et chez la plupart des téléosts, on les trouve sous forme de petits corps dispersés dans la partie exocrine du pancréas .
Le poisson ne possède pas de pancréas discret. Le tissu pancréatique exocrine peut être trouvé dispersé le long du tractus intestinal. La structure acineuse du pancréas exocrine est très similaire à celle des mammifères et comprend des cellules avec un cytoplasme basophile très sombre . Chez les poissons se nourrissant activement, elles contiennent un grand nombre de granules sécrétoires éosinophiles et brillants. L’îlot pancréatique endocrine de Langerhans a pu être distingué, et le tissu comprend des cellules α (produisant du glucagon-like peptide), des cellules β (produisant de l’insuline), et des cellules d (produisant de la somatostatine) . Chez les mammifères et les humains, la plupart des descriptions antérieures au microscope électronique des îlots pancréatiques humains adultes ont été brèves et des parties mineures des publications sont principalement consacrées à des descriptions de tumeurs des cellules β ou à des articles d’enquête discutant de la morphologie comparative des îlots de plusieurs espèces .
Le pancréas des poissons ne s’avère pas souvent être une source prête de tissus pour l’étude au microscope électronique. Le pancréas principal des poissons est à la fois anatomiquement et développementalement similaire au pancréas des mammifères, alors que des différences majeures apparaissent chez d’autres espèces de poissons. Chez le poisson zèbre adulte, le pancréas principal contient plusieurs îlots principaux entourés de tissu exocrine. Une queue d’îlots uniques noyés dans du tissu exocrine et de la graisse s’étend caudalement le long de l’intestin. En revanche, les cellules β du tilapia (un autre poisson téléostéen sensible au glucose) résident dans des îlots de Langerhans situés le long du mésentère et qui ne sont pas entourés de tissu exocrine. Rhamdia quelen est une espèce téléostéenne et une espèce importante pour l’aquaculture dans les climats subtropicaux. R. quelen se trouvent du sud du Mexique au centre de l’Argentine, et l’élevage de cette espèce s’étend vers le sud du Brésil .
Dans la présente étude, nous analysons l’ultrastructure des îlots de Langerhans et décrivons en détail les différents types de cellules sécrétoires chez le poisson-chat sud-américain R. quelen.
2. Matériaux et méthodes
Quatre R. quelem d’élevage deux femelles et deux mâles ( g ; cm) provenant du Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) dans la région nord-est de l’Argentine et stockés dans des réservoirs de 200 L où ils ont été acclimatés pendant deux semaines avant l’autopsie. Les poissons ont été élevés avec de l’eau douce filtrée maintenue à 25°C avec un taux d’échange d’eau de 100% par jour. La photopériode a été ajustée à 12 heures d’obscurité et 12 heures de lumière. Ils ont été nourris à la main quatre fois par jour avec un régime commercial (Ganave). Les poissons ont été euthanasiés avec de la benzocaïne (500 ppm) et nécropsiés et des échantillons de graisse qui s’étend caudalement le long de l’intestin ont été fixés dans du formol tamponné à 10%, noyés dans de la paraffine et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E).
De petits fragments de tissus ont été découpés en blocs de 1 mm et immédiatement fixés dans du glutaraldéhyde tamponné au phosphate (pH 6.9 à 4°C), lavés dans la solution de Millonig et postfixés dans du tétroxyde d’osmium à 1% ; les blocs de tissus ont ensuite été déshydratés dans une série graduelle d’éthanol-acétone, immergés dans de l’oxyde de propylène et inclus dans du Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Suisse). Des sections minces ont été coupées avec un ultramicrotome LKB et doublement colorées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb avant d’être examinées dans un microscope électronique Jeol JEM-8T (Jeol, Tokyo, Japon).
3. Résultats
3.1. Microscopie légère
R. quelen ont des pancréas dispersés dans le tissu adipeux entourant le canal biliaire commun ; ceci se trouve dans une région grossièrement triangulaire délimitée supérieurement par l’estomac, antérieurement par le foie, et inférieurement par la rate et la vésicule biliaire. Chaque îlot de Langerhans est composé de tissu d’îlot relativement pur entouré de pancréas exocrine (Figure 1). Aucune différence entre les hommes et les femmes n’a été observée.
3.2. Microscopie électronique
Les cellules β, qui occupent habituellement l’intérieur des îlots, étaient couramment, mais pas toujours, séparées du pancréas exocrine par les cellules α situées à la périphérie (figure 2). L’aspect ultrastructural des β-cellules était identique dans les échantillons obtenus des quatre poissons. Les β-granules distinctifs étaient contenus dans des sacs à membranes lisses et étaient de taille et de forme variables. Des cristaux rectangulaires, carrés, hexagonaux et irrégulièrement polygonaux étaient visibles. Des formes rondes étaient présentes mais moins fréquemment (Figures 2 à 5). Chaque granule était constitué d’une ou plusieurs formes cristallines ou non structurées de taille et de forme variables. Le choix du fixateur ne semblait pas influencer la structure interne des granules β. Dans les limites de la membrane enveloppante, la zone périphérique aux cristaux semblait vide ou contenait un fin précipité floculant, quel que soit le fixateur utilisé. À des grossissements plus élevés, une sous-structure répétitive était parfois visible dans les cristaux correctement orientés par rapport au plan de coupe (Figures 6 et 7). Les nombreuses mitochondries étaient dispersées dans la cellule et se présentaient sous la forme de structures filamenteuses arrondies ou dodues. Elles étaient plus grandes et plus nombreuses que celles de la cellule β, mais généralement plus petites que celles des cellules acineuses du pancréas. Les nombreux cristaux mitochondriaux étaient, pour la plupart, orientés transversalement, et les granules mitochondriaux étaient présents mais non proéminents. Les citernes du réticulum endoplasmique granulaire étaient généralement courtes ou vésiculaires (Figures 2 à 4). Le réticulum endoplasmique granulaire et les ribosomes libres n’étaient pas une caractéristique aussi importante des cellules β que dans les cellules acineuses ou β. Les cellules β ayant peu de granules sécrétoires étaient normalement plus richement dotées de ribosomes et de réticulum endoplasmique granulaire, qui était alors plus fréquemment de configuration cisternale (figure 5).
Le complexe de Golgi était plus proéminent après la fixation des aldéhydes et les structures composantes étaient plus dilatées (Figure 2). Après l’utilisation de ces fixateurs, un matériau amorphe dense était parfois visible à l’intérieur des vésicules de Golgi et pouvait représenter des granules immatures ou des précurseurs des granules β-sécrétoires. Les noyaux des cellules β étaient généralement sphériques et de contour relativement lisse. La membrane cellulaire des cellules adjacentes des îlots de Langerhans était en étroite apposition avec les desmosomes, bien qu’elle ne soit pas souvent jointe par ces derniers. À la jonction de trois cellules ou plus, les membranes limitantes étaient souvent convolutées, avec des interdigitations tortueuses des cellules (Figures 2 et 9). Des inclusions cytoplasmiques multivésiculaires ressemblant à des céroïdes étaient visibles dans la plupart des cellules β (Figures 2, 7, 9 et 8). L’apparition et la fréquence de ces inclusions n’étaient pas sensiblement affectées par l’utilisation primaire d’acide osmique ou d’aldéhyde comme fixateur, et il n’y avait aucune relation apparente entre la présence de ces granules et les preuves morphologiques d’une activité physiologique des cellules. L’ultrastructure des cellules α était la même dans les quatre échantillons de tissus. La taille et la forme de ces cellules et de leurs noyaux n’étaient pas significativement différentes de celles des cellules β normales (Figures 2 et 7). Bien que l’on ait parfois trouvé une cellule α avec un noyau de forme irrégulière ou en retrait, cela ne se produisait pas assez fréquemment pour servir de critère de différenciation utile. Les granules cytoplasmiques des cellules α ont été préservés par la fixation primaire à l’osmium sous forme de corps denses et sphériques de taille variable, contenus dans des sacs à membranes lisses peu serrés (Figures 7 et 9). Ils étaient plus grands que les β-granules, mais considérablement plus petits que les granules de zymogène des cellules acineuses (Figure 2). Les mitochondries élancées et allongées étaient en nombre modéré et plus petites que celles des cellules β et possédaient des cristaux généralement orientés transversalement. Le réticulum endoplasmique granuleux était souvent de configuration cisternale et plus abondant que dans les cellules β (figure 9). Le complexe de Golgi, lorsqu’il était visible, était de proportions modérées. Des matériaux amorphes denses dans les vésicules et les citernes de Golgi, vraisemblablement les précurseurs des granules sécrétoires, étaient plus fréquents dans les cellules α que dans les cellules β (Figure 10). Les corps céroïdes, bien que fréquemment visibles, étaient moins nombreux que dans les cellules β (figures 2 et 3). Les sacs dans lesquels les α-granules sont situés semblaient donc être complètement remplis, et on a conclu que les granules sont constitués d’un noyau dense interne arrondi et d’un manteau externe moins dense en électrons qui était absent après la fixation de l’osmium (Figures 3 et 9) et donc, peut-être, plus soluble. Aucune sous-structure cohérente n’était visible dans les parties internes ou périphériques des α-granules. À aucun moment on n’a vu de cellules qui pourraient être interprétées comme des formes de transition entre les cellules α et les cellules β. Les α-granules, y compris les portions extérieures et intérieures plus denses, étaient comparables en taille totale aux « δ-granules ». De plus, des cellules intermédiaires sont présentes et contenaient des granules des deux types, ce qui suggère que les cellules δ étaient en fait des cellules α modifiées (Figure 10). Les cellules δ ont été visualisées, bien que presque toujours situées parmi les cellules α, et ont été identifiées et distinguées ultrastructuralement des cellules α sur la base de la plus faible densité électronique et de la plus grande taille globale de leurs granules sécrétoires. De plus, des cellules intermédiaires sont présentes qui contenaient des granules des deux types, ce qui suggère que les cellules δ étaient en fait des cellules α modifiées (figure 11).
Bien qu’il existe une relation inverse entre le nombre de granules sécrétoires et la proéminence du complexe de Golgi et du réticulum endoplasmique granulaire, aucun modèle de libération de α- ou β-granules n’a été observé. Une fine membrane basale et des quantités variables de tissu conjonctif séparent généralement les îlots pancréatiques des cellules acineuses adjacentes (figure 2). Parfois, cependant, aucune membrane basale n’intervenait entre les îlots et les cellules acineuses qui n’étaient alors séparés que par l’étroit espace interstitiel. Les cellules endothéliales capillaires fenêtrées étaient toujours séparées d’elles par au moins la membrane basale capillaire (Figure 9). D’autres éléments de soutien, notamment des composants du collagène et du tissu élastique, étaient aussi parfois présents. Aucune différence entre les mâles et les femelles n’a été observée.
4. Discussion
Les cellules β de poisson se distinguent facilement des cellules α par la morphologie des granules sécrétoires. La présence fréquente de sous-unités angulaires et l’apparente sous-structure répétitive suggèrent une nature cristalline pour les β-granules. Les tentatives de résolution et de mesure des dimensions d’un réseau cristallin n’ont pas encore abouti. Lorsque les granules sécrétoires ont été visualisés à proximité du complexe de Golgi, les sous-unités cristallines n’ont généralement pas été observées. Il est donc tentant de spéculer que les granules non cristallins ou le matériau amorphe à l’intérieur du complexe de Golgi représentent une forme chimique ou physique d’insuline ou de complexe protéique d’insuline différente des sous-unités cristallines du granule. On ne sait pas si ces différentes formes morphologiques au sein des β-granules ont des solubilités différentes et peut-être des modèles différents de libération en réponse à la demande physiologique. Les granules sécrétoires n’ont pas été observés dans les citernes ou les vésicules du réticulum endoplasmique granulaire. On suppose que, comme pour les autres cellules sécrétrices de protéines, le complexe de Golgi a pour fonction de concentrer ou d' »emballer » le produit synthétisé dans le réticulum endoplasmique granulaire. Il s’ensuivrait logiquement que les sacs à membrane lisse dans lesquels sont contenus les granules sécrétoires sont dérivés des membranes de Golgi plutôt que du réticulum endoplasmique granulaire.
Les cellules α avec leurs granules sécrétoires larges, arrondis et denses sont assez semblables aux cellules α d’autres espèces. Bien que les granules des cellules α soient de dimensions très variables, la plupart des cellules semblent posséder un assortiment de granules de tailles différentes, ce qui exclut une sous-classification de ce type cellulaire comme cela a été suggéré pour d’autres espèces . A ce jour, aucune donnée physiologique n’a été publiée pour soutenir l’existence de la « cellule δ » dans l’îlot pancréatique du poisson. Les différents protagonistes ont soutenu l’existence des cellules δ avec des données basées sur des examens de microscopie légère d’argent capricieux, d’acide phosphotungstique-hématoxyline, et d’autres taches de granules ou des études de microscopie électronique de tissus mal conservés. Les micrographies présentées ici soutiennent l’opinion considérée par Bloom en 1931, puis par Gomori en 1941, selon laquelle les cellules δ pourraient représenter des cellules α modifiées.
La transition du granule α typique, avec des portions internes denses et externes moins denses, à un granule δ d’approximativement la même taille, avec une densité uniforme mais diminuée, est souvent accompagnée d’une perte graduelle de l’intégrité morphologique ou de l’intensité de coloration des mitochondries, du complexe de Golgi et des composants membranaires du réticulum endoplasmique granulaire. Les noyaux intacts et d’apparence viable, ainsi que la persistance d’un petit nombre de ribosomes libres et de corps céroïdes, suggèrent que les cellules dites δ sont viables même au stade final présumé de cette transition, c’est-à-dire lorsque les granules sécrétoires eux-mêmes ne sont plus visibles et que tous les organites cytoplasmiques autres que les granules céroïdes et les ribosomes sont absents. En l’absence de données physiologiques attribuant une fonction aux cellules δ et en l’absence de preuves morphologiques plus convaincantes pour un type cellulaire distinct, nous espérons que la présentation ici d’une transition probable des cellules α aux cellules δ sera acceptée comme l’explication la plus probable de la troisième cellule granulaire de Bloom chez l’homme . La signification de ces cellules α viables mais altérées n’est pas connue. Bien que des cellules α- et β-, isolées ou en petits groupes, puissent être observées à l’intérieur des acini et des canaux, à aucun moment, dans aucun des quatre échantillons pancréatiques étudiés, on n’a observé de formes intermédiaires entre les cellules des acini et des îlots ou des canaux et des îlots, comme cela avait été suggéré par Nakamura et Yokote (4).
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Reconnaissance
L. A. Romano a reçu des bourses de recherche de productivité du Conseil brésilien de la recherche, CNPq (Processus n° PQ 301002/2012-6).