Introduction

En tant que poudre blanche, incolore et cristalline, l’azide de sodium (NaN3) est classé comme une substance hautement toxique. Ses effets toxiques sont similaires à ceux du cyanure, et il endommage les systèmes nerveux et cardiovasculaire, les yeux et la peau. Ce toxique devient actif rapidement après l’ingestion et ses principaux effets se produisent plusieurs heures après l’ingestion orale, en fonction de la quantité ingérée (1,2). L’exposition au NaN3 peut induire un certain nombre de symptômes en quelques minutes, notamment des nausées, des vomissements, des maux de tête, une agitation, des vertiges, une faiblesse, une respiration rapide et un rythme cardiaque accéléré (3). Des quantités élevées de cet élément toxique provoquent immédiatement des convulsions, une perte de conscience, une baisse de la fréquence cardiaque et de la pression artérielle et une défaillance respiratoire, entraînant finalement la mort (3). Parmi les mécanismes d’action démontrés du NaN3, le plus pertinent est l’inhibition du complexe cytochromec oxydase-chaîne respiratoire (4). Des études antérieures ont révélé que le NaN3, un inhibiteur du complexe IV (Cox IV), peut induire une apoptose dans les neurones corticaux primaires, qui est dépendante de la caspase-3 et associée à la libération de cytochrome c (5).

Dans la biosynthèse mitochondriale, le promoteur de la chaîne respiratoire Cox IV peut être activé par les facteurs respiratoires nucléaires (Nrf)-1/2. Parallèlement, Nrf peut être ajusté en régulant l’activité des gènes codant le facteur de transcription mitochondrial A (Tfam) pour réguler indirectement les niveaux d’expression des gènes de la chaîne respiratoire. Nrf-1/2, Tfam, le co-activateur 1-α (Pgc-1α) du récepteur γ activé par les proliférateurs de peroxysomes et d’autres co-activateurs constituent la cascade de signaux Pgc-1α, qui joue un rôle central dans un réseau de régulation régissant le contrôle transcriptionnel de la biogenèse mitochondriale et de la fonction respiratoire. Dans cette cascade de signaux, Pgc-1α active d’abord Nrf-1/2 plutôt que de se lier directement à l’ADN mitochondrial, et Nrf-1/2 induit l’activation de Tfam en combinaison avec le promoteur de Tfam et déclenche la transcription et la réplication de l’ADN mitochondrial, conduisant à une augmentation des niveaux d’expression des protéines mitochondriales(6). Parallèlement, la Pgc-1α peut être activée par les voies de signalisation médiées par CaN-, Ca2+/calmodulin-dependent proteinkinase (CaMK)-, mitogen-activated protein kinase (MAPK)- etcyclin-dependent kinase (7). Dans la présente étude, les cellules PC12 ont été utilisées pour générer un modèle de neurones dopaminergiques, et les effets et le mécanisme du NaN3 sur les voies associées à Pgc-1α dans les cellules PC12 ont été étudiés, afin d’identifier si le NaN3 induit une toxicité dans les cellules PC12 en culture et les mécanismes sous-jacents impliqués dans ces effets.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Les cellules PC12 de phéochromocytome de rat ont été achetées auprès de la banque de cellules de la collection de culture de type de l’Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Une solution mère de NaN3 (Sigma-Aldrich ; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) a été dissoute dans une solution saline stérile pour obtenir une solution mère de 1 M, qui a ensuite été diluée aux concentrations souhaitées avant l’expérimentation. Un kit de test d’apoptose TUNEL en une étape (C1090), un kit de détection d’apoptose Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) (C1063), un kit de test amélioré d’adénosine 5′-triphosphate (ATP) (S0027), Kit de dosage du potentiel membranaire mitochondrial JC-1 (C2006)et kit de dosage des espèces réactives de l’oxygène (S0033) ont été fournis parBeyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Chine).

Culture cellulaire et essai de viabilité

Les cellules PC12 ont été maintenues dans le milieu Dulbecco’s modifiedEagle’s (DMEM ; Hyclone ; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS;Gibco ; Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, USA) et une solution antibiotique antimycosique à 1 % composée de 10 000 U de pénicilline et 10 000 U de streptomycine. Les cellules ont été incubées à 37°C dans une atmosphère inhumidifiée à 5% de CO2 et toujours utilisées à 70-80% de confluence.

La viabilité des cellules PC12 a été déterminée à l’aide d’un kit de comptage cellulaire (CCK-8 ; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, Chine). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1×105/puits. Après 24 heures de culture, les cellules ont été traitées au NaN3 (0-80 mM) et incubées pendant 12, 24, 48 et 72 heures pour établir le modèle de lésion cellulaire. Ensuite, 10 µl de solution de CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 2 heures supplémentaires dans des conditions standard (37°C et 5% de CO2). L’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm a été déterminée par le lecteur de microplaques ELx808 Absorbance (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). La viabilité cellulaire a été calculée en fonction de la densité optique moyenne de 6 puits. Les expériences ont été réalisées en triplicata. Les concentrations appropriées de NaN3 à utiliser dans les expériences suivantes ont été déterminées en fonction des résultats des tests de viabilité cellulaire.

Morphologie nucléaire des cellules PC12 colorées au DAPI

Les cellules PC12 ont été exposées à 0, 10, 20 et 40 mMNaN3 pendant 24 heures. Afin de distinguer la mort cellulaire programmée de la mort cellulaire non apoptotique, les noyaux ont été colorés avec 10µg/ml de DAPI (C1005 ; Beyotime Institute of Biotechnology). En bref, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis fixées avec du paraformaldéhyde à 4% à température ambiante pendant 30 minutes. Après trois lavages, les cellules fixées ont été colorées avec du DAPI (1:5 000) pendant 5 minutes, puis lavées avec du PBS. Les images de fluorescence ont été acquises avec un microscope à fluorescence Leica DMI (grossissement, ×400).

Mesure du taux d’apoptose

Un kit de détection d’apoptose Annexin V-FITC/PI(Beyotime Institute of Biotechnology) a été utilisé pour déterminer l’apoptose des cellules selon les instructions du fabricant.Les expériences ont été répétées en triplicat et ont été réalisées comme suit : Les taux d’apoptose des cellules PC12 témoins (0 mMNaN3) et des cellules PC12 exposées à 10, 20 et 40 mMNaN3 pendant 24 heures ont été mesurés par cytométrie en flux (FC500;Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel statistique SPSS v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA).

Mesure du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm)

ΔΨm est un paramètre significatif du fonctionnement des mitochondries. Il a été évalué par coloration avec JC-1, une sonde fluorescente. Les expériences ont été répétées en triplicat, et ont été réalisées comme suit : Les cellules PC12 témoins ont été traitées avec 0 mM de NaN3 ; et les cellules PC12 expérimentales ont été exposées à 10, 20 et 40 mM de NaN3 pendant 24 heures. Ensuite, conformément au protocole du fabricant (C2006 ; kit de test du potentiel membranaire mitochondrial ; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Chine), les cellules ont été incubées avec le milieu contenant du JC-1 (1X) à 37°C pendant 20 minutes, les cellules ont été lavées trois fois avec un tampon de lavage et recueillies avec du milieu frais sans sérum. Parallèlement, le contrôle positif a été traité avec le cyanure de carbonyle 3-chlorophénylhydrazone (CCCP), un inhibiteur, (10 µM) à 37°C pendant 20 minutes. Ensuite, la fluorescence rouge/verte a été déterminée par FCM(FC500 ; Beckman Coulter, Inc.). Les rapports de l’intensité de la fluorescence rouge sur l’intensité de la fluorescence verte représentaient les niveaux de ΔΨm.

Mesure de la production d’espèces réactives de l’oxygène(ROS)

Les ROS dans les cellules PC12 ont été évalués à l’aide d’un kit de dosage des espèces réactives de l’oxygène (S0033 ; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, Chine). La génération de ROS intracellulaires a été évaluée au moyen du 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA),une sonde fluorescente. Les ROS intracellulaires oxydent le DCFH-DA, donnant le composé fluorescent 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF), et l’intensité de la fluorescence du DCF est considérée comme étant parallèle à la quantité de ROS formés, selon les instructions du kit de dosage des ROS.Les expériences ont été répétées en trois exemplaires et réalisées comme suit : les témoins positifs ont été traités avec une concentration spécifique de Rosup (50 mg/ml) ; les cellules PC12 de contrôle ont été traitées avec 0 mMNaN3 ; et les cellules PC12 expérimentales ont été exposées à 10, 20 et 40 mM NaN3 pendant 24 h. En outre, les cellules PC12 ont été traitées avec du DCFH-DA (10 mM) dissous dans du DMEM sans sérum (1:1 000) pendant 20 min à 37°C, puis lavées trois fois avec du DMEM sans sérum. Le contrôle positif a été traité avec du Rosup, pour induire la production de ROS. La production de ROS a été déterminée par FCM (FC500;Beckman Coulter, Inc.). Les intensités de fluorescence moyennes (MFI) représentaient les niveaux de ROS.

Mesure du contenu cellulaire en ATP dans les cellules PC12

Les expériences ont été répétées en trois exemplaires et réalisées comme suit : Les cellules PC12 témoins ont été traitées avec 0 mMNaN3 ; et les cellules PC12 expérimentales ont été exposées àNaN3 à différentes concentrations (10, 20 et 40 mM) pendant24 h. Par la suite, le contenu cellulaire en ATP a été déterminé à l’aide d’un kit de test ATP LuciféraseFirefly (Beyotime Institute ofBiotechnology) selon le protocole du fabricant.

Analyse Western blot

Les cellules PC12 ont été exposées à 0, 10, 20 et 40 mMNaN3 pendant 24 h, lysées dans un tampon d’analyse de radioimmunoprécipitation (Beyotime Institute of Biotechnology) contenant un inhibiteur d’aprotéase et centrifugées à 13 362 × g pendant 10 min à 4°Cafin de recueillir les surnageants. Ensuite, les concentrations en protéines ont été déterminées à l’aide du kit BCA (Pierce ; Thermo FisherScientific, Inc.). Des quantités égales de protéines (90 µg) ont été soumises à une SDS-PAGE à 10 et 12 %, puis transférées sur des membranes de polyfluorure de vinyle (0,45 µm) à l’aide d’une unité d’électrotransfert Semidry (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Après blocage avec de l’albumine de sérum bovin à 5% dans du TBS contenant 0.1 % Tween-20 (TBST) pendant 2 heures à température ambiante, les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires contre Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA ; 1:500), Nrf-2 (Abcam ; 1:500), Cox IV (Abcam ; 1:1 000), Tfam (Abcam ; 1:1 000), procaspase-3 (Abcam ; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc, Danvers, MA, USA, 1:500), pan-calcineurine A (CaN ; Cell Signaling Technology Inc. ; 1:1 000), CaMKII (Cell Signaling Technology ; 1:1 000) phosphorylé (p), MAPK p-p38 (Cell SignalingTechnology, Inc.; 1:1 000), p-extracellular signal-regulated kinase(Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc. ; 1:1 000), protéine X associée au lymphome B-cellulaire-2 (Bcl-2) (Bax ; Santa CruzBiotechnology, Inc, Dallas, TX, USA ; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc. ; 1:200) et cytochrome c (Santa CruzBiotechnology, Inc. ; 1:200) à 4°C pendant la nuit. Les membranes ont ensuite été lavées avec TBST et incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (lapin ; cat. no. A0208;1:1,000 ; ou souris ; cat. no. A0216 ; 1:1 000 ; tous deux du Beyotime Institute of Biotechnology) pendant 1 heure à température ambiante. Les bandes immunoréactives ont été visualisées par le système de chimiluminescence améliorée (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Chine) et analysées quantitativement avec Image J version l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA), et la β-actine a été choisie comme contrôle de charge.

Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel statistique SPSS v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Les données sont exprimées sous la forme de la moyenne ± l’écart-type et l’erreur standard de la moyenne. La signification statistique des différences entre les groupes a été déterminée par une analyse de variance à sens unique suivie de tests post-hoc de Bonferroni. P<0,05 a été considéré comme indiquant une différence statistiquement significative. Chaque expérience a été répétée au moins trois fois.

Résultats

NaN3 inhibe la croissance des cellules PC12

L’effet de l’exposition au NaN3 sur laprolifération des cellules PC12 a été évalué par le test CCK-8. Les cellules ont été exposées à différentes concentrations (0-80 mM) de NaN3 pendant 12-72 h. Le tableau I et les figures 1A-D indiquent que la viabilité cellulaire a été réduite par le NaN3 de manière dépendante de la concentration. Presque 100% des cellules sont mortes après une exposition à 80 mM de NaN3 pendant 72 h, ce qui indique que le NaN3 a induit la mort cellulaire de façon marquée, et que la cytotoxicité du NaN3 a été détectée de façon dépendante de la dose et du temps. L’exposition au NaN3 à une concentration de 20 mM pendant 24 h a provoqué une mort cellulaire marquée dans les cellulesPC12 (50 %). Par conséquent, les cellules cultivées pendant 24 h ont été utilisées pour les expériences suivantes.

Morphologie cellulaire

En coloration DAPI, les changements morphologiques des cellules PC12 ont été observés par microscopie à fluorescence après exposition à différentes concentrations de NaN3. La fragmentation des noyaux cellulaires exposés au NaN3 pendant 24 h a été observée, et le rétrécissement des noyaux cellulaires et la condensation de la chromatine ont légèrement augmenté avec la concentration de NaN3 dans les cellules PC12 par rapport au contrôle. Dans ces cellules, les cellules apoptotiques étaient plus petites et plus brillantes que les cellules normales. Une chromatincondensation et une fragmentation nucléaire ont également été observées, alors que des noyaux bleus de cellules viables ont été identifiés dans le groupe témoin.En outre, le nombre de cellules apoptotiques et l’intensité de la fluorescence verte ont augmenté dans les cellules exposées auNaN3 (Fig. 2).

Détermination du taux d’apoptose par coloration à l’Annexin V-FITC

Les cellules mortes ou les cellules apoptotiques tardives qui ont perdu l’intégrité de la membrane cellulaire peuvent être colorées par l’iodure de propidium. La figure 3 montre que le nombre de cellules apoptotiques était de 5,03, 8,02, 43,77 et 78,67 % (P<0,05) dans les cellules PC12 après exposition au NaN3 à différentes concentrations (0, 10, 20 et 40 mM) pendant 24 heures, respectivement. Ces résultats ont en outre confirmé que leNaN3 induisait l’apoptose cellulaire de manière dose-dépendante.

Changements du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm)

Les mitochondries sont généralement considérées comme des organismes régulateurs clés impliqués dans la viabilité cellulaire. Par conséquent, le ΔΨm a été utilisé comme indicateur de la fonction mitochondriale. Les cellules PC12 ont été colorées avec du JC-1, un colorant cationique qui présente une accumulation dépendante du potentiel dans les mitochondries. Une fluorescence rouge (agrégats J), représentant des mitochondries actives avec un potentiel de membrane stable, a été observée dans un petit nombre de cellules exposées à des concentrations croissantes de NaN3. En revanche, une fluorescence verte (J-monomère), représentant des mitochondries apoptotiques dont le ΔΨm est endommagé, a été observée dans un certain nombre de cellules. Le rapport entre la fluorescence rouge et verte a progressivement diminué dans le groupe témoin (Fig. 4).

Accumulation de ROS mitochondriaux induite par le NaN3

Il est bien connu que les mitochondries sont la source primaire de ROS cellulaires, et que les ROS jouent un rôle important dans l’activation de la signalisation apoptotique. Par conséquent, le rôle des ROS dans la mort des cellules PC12 induite par le NaN3 a été étudié de manière complémentaire. La figure 5 indique que les intensités de fluorescence des cellules témoins et des cellules exposées au NaN3 à différentes concentrations (0, 10, 20 et 40 mM) pendant 24 heures étaient de 3,65, 6,99, 18,63 et 39.35, respectivement,indiquant que l’exposition au NaN3 a significativement augmenté la production de ROS mitochondriaux par rapport au groupe témoin(P<0,05). Ces résultats suggèrent que l’apoptose induite par le NaN3 améliore la production de ROS intracellulaires.

Le NaN3 dérégule la production d’énergie mitochondriale de l’ATP cellulaire

Pour évaluer le contenu en ATP des cellules PC12 exposées auNaN3, l’unité de luminescence relative (RLU) a étéquantitativement déterminée par un luminomètre. La figure 6 indique que le NaN3inhibe la production mitochondriale d’ATP et diminue progressivement le niveau d’ATP cellulaire (P<0,05).

Niveaux d’expression de Pgc-1α et des protéines associées à l’apoptose dans les cellules PC12

L’expression de Pgc-1α au niveau protéique a été significativement diminuée après l’exposition au NaN3 par rapport au contrôle (P<0,05). En outre, Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2,Nrf-2 et Cox IV sont des cibles en aval bien connues de la dynamique de Pgc-1α dans divers types de cellules (8). La présente étude a identifié que l’exposition au NaN3 inhibait significativement la dynamique de Pgc-1α de manière dose-dépendante (P<0,01 ; Fig. 7A).

En outre, l’exposition au NaN3 a augmenté les niveaux d’expression de Bax et de cytochrome c, tandis qu’elle a diminué les niveaux d’expression de Bcl-2 et de procaspase-3(P<0,05). Le rapport Bax/Bcl-2 était également significativement augmenté par rapport au groupe témoin (P<0,05 ; Fig. 7B).

Les niveaux d’expression protéique d’autres membres importants, y compris CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK et p-p38 MAPK,ont également été évalués. Les résultats indiquent que le NaN3 augmente l’expression de CaN et la phosphorylation de CaMKII et de p38 MAPK par rapport au groupe témoin, tandis que les niveaux d’expression de CaMKII total et de p38 MAPK ne sont pas modifiés. En outre,les ratios de p-CaMKII/CaMKII et de p-p38/p38 MAPK dans le groupeNaN3 étaient significativement augmentés par rapport à ceux du groupe témoin (P<0,01 ; Fig. 7C).

Discussion

Pour déterminer si le NaN3 inhibait laprolifération des cellules PC12, le nombre de cellules traitées en phase logarithmique a été comparé au nombre de cellules témoins non traitées. La croissance cellulaire a été inhibée de ~75% après 24 heures d’exposition à 20 mM de NaN3. Par conséquent, cette concentration a été utilisée pour les expériences suivantes. L’apoptose implique des changements dans la morphologie cellulaire, y compris l’éclatement de la membrane, le rétrécissement cellulaire, la condensation de la chromatine, la fragmentation nucléaire et la fragmentation de l’ADN (9). Pour analyser la morphologie nucléaire de l’apoptose et le taux d’apoptose, les cellules ont été exposées à 0, 10, 20 et 40 mM de NaN3 pendant 24 h. Après le traitement, les cellules ont été colorées avec du DAPI et de l’AnnexinV-FITC/PI, et la distribution des noyaux a été analysée. Les résultats ont confirmé que l’exposition au NaN3 a induit l’apoptose des cellules PC12 de manière concentration-dépendante.

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses fonctions métaboliques, y compris le maintien du pH intracellulaire et la production de ROS, qui favorisent et régulent l’apoptose cellulaire (10). Les caractéristiques de l’apoptose cellulaire sont précédées par des altérations mitochondriales, notamment une perte de ΔΨm, une diminution de la production d’énergie (ATP) et une augmentation de la perméabilité de la membrane mitochondriale. Des études antérieures ont suggéré que les SRO déclenchent des dommages à la chaîne respiratoire mitochondriale et induisent la perte de ΔΨm, qui sont les facteurs qui médient ou amplifient le dysfonctionnement neuronal au cours de la neurodégénérescence, conduisant par conséquent au développement de maladies neurodégénératives (11,12).Le NaN3 est connu pour entraîner la dégénérescence et l’excitotoxicité en augmentant le potentiel de perméabilité de la membrane mitochondriale par la peroxydation des lipides (13-15), et le NaN3 exerce sa principale action toxique en inhibant la fonction du cytochrome oxydase dans la chaîne de transport d’électrons mitochondriale et en empêchant la production d’ATP (4). Dans la présente étude, la FCM a été utilisée pour identifier le ΔΨm et la production de ROS dans les cellules PC12. De plus, la synthèse d’ATP dans les mitochondries a été examinée après une exposition à différentes concentrations de NaN3. La perturbation de la membrane plasmique, l’augmentation de la production de ROS mitochondriaux et la diminution de la teneur en ATP cellulaire observées ont suggéré que l’exposition au NaN3 a induit l’apoptose dans les cellules PC12.

La mort cellulaire mitochondriale peut être activée par de multiples stimuli, y compris le programme de développement, les dommages à l’ADN, le stress du réticulum endoplasmique, le facteur de croissance et la privation de nutriments, l’infection virale et le stress oxydatif (16). En tant que membre de la famille toujours croissante des corégulateurs nucléaires, Pgc-1α peut activer un large ensemble de gènes et réguler les niveaux d’expression des gènes impliqués dans le métabolisme énergétique en réponse aux voies de signalisation qui médiatisent la thermogenèse, la gluconéogenèse, le changement de type de fibre musculaire et la biogenèse mitochondriale (17).Ces corégulateurs existent et fonctionnent dans de grands complexes multiprotéiques, dans lesquels, plutôt que de se lier à l’ADN, ils régulent le Nrf-1/2 et le Tfam et modulent leur pouvoir transcriptionnel en favorisant les interactions biochimiques ultérieures requises pour l’induction ou la répression de la transcription des gènes (8). En outre, Nrf-1/2 contrôle aussi indirectement l’expression des gènes codés par l’ADN mitochondrial en induisant de façon potentielle les Tfam A, B1 et B2 (Tfam, Tfb1m et Tfb2m, respectivement) codés par le noyau, qui sont les régulateurs de la transcription et de la réplication du génome mitochondrial (18). Des études antérieures ont démontré que le NaN3 est un inhibiteur du complexe IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, qui est fréquemment affecté dans les troubles mitochondriaux primaires (19,20).Dans la présente étude, l’expression de la cascade de signaux Pgc-1α, y compris les protéines de la famille Pgc-1α (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 et Tfam) et Cox IV, a d’abord été examinée dans les cellules PC12 pour vérifier si les événements de signalisation étaient impliqués dans l’apoptose induite par le NaN3. Les résultats suggèrent que l’apoptose induite par le NaN3 est associée aux niveaux d’expression des protéines de la famille Pgc-1α et de Cox IV dans la voie de signalisation médiée par les mitochondries. Lorsque les concentrations de NaN3 ont été augmentées, les niveaux d’expression de ces protéines ont été significativement diminués, ce qui indique qu’ils peuvent être impliqués dans l’activation et le développement de l’apoptose.

A l’inverse, le complexe IV peut déclencher l’apoptose dans les neurones corticaux primaires, qui est caspase3-dépendante et associée à la libération de cytochrome c (5). Il est bien connu que les mitochondries sont des régulateurs clés de l’apoptose cellulaire. Les protéines de la famille Bcl-2 sont les initiateurs importants de la voie apoptotique mitochondriale. Cette famille comprend les protéines pro-apoptotiques Bax, l’antagoniste/tueur homologue de Bcl-2 et l’agoniste de la mort cellulaire associé à Bcl-2, ainsi que les protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-extra large (Bcl-xL). Dans les cellules saines, Bax est une protéine cytosolique inactive, mais elle est transférée dans les mitochondries pendant l’apoptose. Elle exerce ses effets pro-apoptotiques en formant un pore dans la membrane externe de la mitochondrie, par lequel le cytochrome c est libéré dans le cytoplasme, ce qui entraîne l’activation de la caspase 3 (21). Les protéines anti-apoptotiques Bcl-2et Bcl-xL suppriment la fonction de Bax en maintenant l’intégrité de la membrane mitochondriale, ce qui empêche la libération du cytochrome c dans le cytoplasme et l’activation de la caspase 3 (22). Dans la présente étude,NaN3 a augmenté les niveaux de Bax pro-apoptotique et de cytochrome c et a diminué les niveaux de Bcl-2 anti-apoptotique et de la caspase 3, ce qui indique que NaN3 a initié la signalisation de l’apoptosemitochondriale dans les cellules PC12.

En outre, les niveaux d’expression des coactivateurs Pgc-1α sont hautement inductibles au niveau transcriptionnel via une variété de voies de signalisation en amont. Par exemple, l’expression de Pgc-1α est induite par l’exercice et l’exposition au froid sous le contrôle de la signalisation du stress via le Ca2+ cellulaire et la signalisation de l’adénosine 5′-monophosphate cyclique (AMPc) (23). La transcription de Pgc-1α peut être affectée par CaMK, calcineurine, récepteur β-adrénergique/AMP et p38MAPK (24-26). En outre, p38 MAPK, qui appartient à la famille MAPK, joue un rôle central dans la prolifération, la différenciation, la transformation et l’apoptose des cellules, puisque l’activation de l’apoptose peut induire Pgc-1α par phosphorylation directe (27). Dans la présente étude, les niveaux d’expression des protéines des voies de signalisation du Ca2+ (pan-calcineurine A et p-CaMKII/CaMKII) et de la voie p38 MAPK (p-p38MAPK/p38 MAPK et p-Erk1/2) ont été examinés pour étudier les effets du NaN3 sur l’homéostasie intracellulaire du Ca2+ et sur p38 MAPK. Les données ont indiqué que les niveaux de protéine de la pan-calcineurine A, et les ratios p-CaMKII/CaMKII et p-p38MAPK/p38 MAPK étaient augmentés et que le niveau de p-Erk1/2 était diminué dans le groupe traité au NaN3, ce qui suggère que le NaN3 a déclenché l’apoptose des cellules PC12 de manière adose-dépendante, et qu’une telle activation était associée aux voies Ca2+ et p38 MAPK. Dans l’ensemble, ces résultats expérimentaux ont confirmé que le NaN3 peut induire l’apoptose des cellules PC12 en activant les voies Ca2+ et p38 MAPK. Au meilleur de nos connaissances, la présente étude a révélé pour la première fois que le NaN3 a induit l’apoptose médiée par la mitochondrie dans les cellules PC12 à travers les voies de signalisation associées àPgc-1α, y comprisCa2+/p-CaMKII et p38 MAPK.

En résumé, la présente étude a démontré que leNaN3 peut induire l’apoptose des cellules PC12. Afin d’élucider le mécanisme toxique sous-jacent de l’exposition au NaN3, les niveaux d’expression d’une série de protéines pro-apoptotiques (Bax et cytochrome c) et de protéines anti-apoptotiques (Bcl-2, procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII et Pgc-1α) ont été examinés. Les résultats ont confirmé que les protéines pro-apoptotiques exerçaient des effets pro-apoptotiques sur les cellules PC12 via l’activation et la phosphorylation de CaMKII et p38 MAPK, ce qui a stimulé l’activation de Pgc-1α et de la procaspase-3 dans les cellules PC12. Ces données constituent une base pour des études ultérieures visant à étudier les mécanismes d’action du NaN3 au niveau moléculaire. Les études futures peuvent inclure l’ajout d’agents protecteurs, par exemple l’inhibiteur de la division mitochondriale 1,un dérivé de la quinazolinone qui est un inhibiteur de la division mitochondriale nouvellement identifié, avant le traitement au NaN3, afin d’étudier les effets neuroprotecteurs de l’agent protecteur dans l’atténuation de l’apoptose induite par le NaN3 dans les cellules PC12, et d’élucider en outre le mécanisme sous-jacent.

Remerciements

Sans objet.

Financement

La présente étude a été soutenue financièrement par les subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (grantno. 81571848) et le développement du programme académique prioritaire des institutions d’enseignement supérieur deJiangsu.

Disponibilité des données et des matériaux

Les ensembles de données utilisés ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable.

Contributions des auteurs

YZ et SZ ont conçu et dessiné l’étude. YZ, JH, HX, TG et YW ont acquis les données. YZ, JH et HX ont analysé et interprété les données, et ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont révisé de manière critique le manuscrit, et ont lu et approuvé la version finale du manuscrit.

Approbation éthique et consentement à participer

Sans objet.

Consentement du patient pour la publication

Sans objet.

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêts concurrents.

Glossaire

Abréviations

Abréviations :

.

.

NaN3	sodium azide
Cox IV	complexe. IV
Tfam	facteur de transcriptionmitochondrialA
Nrf-1/2	facteur respiratoire nucléaire-1/2
CaN	pan-calcineurine A
Pgc-1α	peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-.α
PC12	phéochromocytome rat
ΔΨm	Potentiel de membranemitochondriale
CCCP	carbonyl cyanide3-.chlorophénylhydrazone
ROS	espèces réactives de l’oxygène
FCM	cytométrie de flux
MAPK	mitogène-protéine kinase activée

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