Etudes de recherche
Dans nos études, nous avons examiné une seule culture de l’UE, Pisum sativum (pois). Les pois sont sensibles à un large éventail de virus, notamment le virus de la mosaïque de l’enation du pois, le virus du brunissement précoce du pois et une série de virus du groupe du virus Y de la pomme de terre (Potyviridae). Au sein de ce dernier groupe, le Bean yellow mosaic virus, le Bean common mosaic virus, le Pea mosaic virus et le Pea seed borne mosaic virus (PSbMV) sont tous des pathogènes importants. Nous avons étudié en particulier le PSbMV pour lequel tous les cultivars commerciaux de pois sont sensibles. Cette sensibilité est aggravée par le fait que ce virus n’est pas seulement transmis de plante à plante par son puceron vecteur mais qu’il est également transmis verticalement de génération en génération dans les semences. Cette propriété a entraîné une grave contamination des collections de germoplasme de pois et constitue un moyen très efficace de donner une infection précoce et généralisée des cultures peu après la germination des graines. Si l’on considère qu’une efficacité de transmission des semences de seulement 0,1 % entraînerait 10 000 infections après avoir semé des graines à 107/hectare, l’importance de la transmission des semences devient évidente. À l’heure actuelle, ce problème est contré par un test post-récolte efficace des échantillons de semences par immunodétection de la protéine de l’enveloppe du virus, et par le rejet des lots de semences contaminés. Comme alternative, et puisque la transmission des semences dans une gamme de cultivars de pois varie de 0 à 100%, nous avons cherché à savoir si la résistance à la transmission des semences pouvait être sélectionnée dans des lignées de pois améliorées. Dans les tests de croisement et les rétrocroisements entre des lignées ne présentant aucune transmission ou une transmission de 60-80%, la résistance s’est comportée comme un caractère dominant, bien que dans les générations F2 et BC2, elle ne se soit pas séparée comme un trait mendélien. La nature quantitative du phénotype suggère que la transmission par les semences serait difficile à inclure comme trait de résistance dans un programme de sélection conventionnel.
La résistance naturelle au PSbMV a été identifiée dans des accessions de pois d’Afrique du Nord et d’Asie bien que, jusqu’à présent, ces gènes récessifs n’aient pas été introgressés dans des lignées commerciales. L’analyse génétique a montré que ces gènes sont regroupés avec d’autres gènes récessifs présentant des spécificités différentes vis-à-vis du potyvirus à deux endroits du génome du pois. Les gènes sbm-1, sbm-3 et sbm-4, conférant la résistance aux pathotypes PI, L-l et P4 du PSbMV, respectivement, sont situés sur le chromosome 6, tandis que sbm-2, conférant également la résistance au pathotype L-l, est situé sur le chromosome 2 . Bien que cette organisation suggère une conversion et une translocation locales des gènes entre les chromosomes 2 et 6, d’autres preuves suggèrent que les deux groupes de gènes peuvent avoir une origine et une fonction distinctes. En utilisant des virus hybrides recombinants fabriqués entre différents pathotypes, le déterminant d’avirulence du virus a été défini comme la protéine liée au génome du virus (VPg) pour sbm-1 . Une analyse structurelle et fonctionnelle du gène sbm-1 est le sujet d’un projet CE-Biotechnologie # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) impliquant des groupes de recherche et l’industrie du Danemark, de la Finlande, de l’Espagne et du Royaume-Uni.
La caractérisation du gène sbm-1 fournira des récompenses intellectuelles et pratiques particulières. Étant donné qu’environ 20 % de tous les gènes de résistance aux virus et environ 40 % des gènes conférant une résistance aux potyvirus sont récessifs, la compréhension du fonctionnement de sbm-1 et de ce qui contrôle la spécificité du sbm- adjacent et des autres gènes de résistance aux potyvirus sera importante pour un large éventail de maladies. Cependant, le projet sbm- présente également des défis techniques, notamment celui de devoir faire face à la taille et à la redondance du génome du pois. Le génome du pois compte environ 5 x 109 paires de bases par génome haploïde, soit quelque 50 fois plus que celui d’Arabidopsis thaliana. Le clonage cartographique des gènes du pois n’a pas été réalisé et les grandes bibliothèques d’insertion ne sont pas encore disponibles. Cependant, il existe un potentiel dans sbm-1 pour identifier une nouvelle classe de gènes de résistance. Les gènes de résistance clonés jusqu’à présent chez d’autres espèces se répartissent en deux catégories. Les gènes de résistance dominants, qui fonctionnent contre des virus, des champignons et des bactéries spécifiques, appartiennent largement à la classe « NBS-LRR » et assurent une résistance hypersensible à l’infection. Le seul gène récessif à avoir été cloné (mlo) est le médiateur d’une résistance non spécifique à l’oïdium de l’orge et est également associé à la localisation de l’agent pathogène dans les cellules mortes. Fonctionnellement, Mlo agit comme un régulateur négatif de la résistance constitutive. En revanche, sbm-1 est spécifique de la race (ou du pathotype) et n’est pas associé à la mort cellulaire. A partir de ces comparaisons, plusieurs mécanismes fonctionnels pour sbm-1 semblent possibles. Premièrement, nous pouvons considérer Sbm-1 comme un facteur de susceptibilité dominant, nécessaire pour aider à la réplication du virus. Cela correspondrait à l’implication probable du VPg dans la réplication de l’ARN viral et à l’observation que les protoplastes de plantes résistantes ne présentent aucune réplication virale détectable. Deuxièmement, comme Mlo, Sbm-1 pourrait agir comme un régulateur négatif de la résistance bien que les différences de spécificité par rapport à mlo placeraient sbm-1 dans une classe distincte de gènes de résistance. Troisièmement, sbm-1 pourrait être un allèle de résistance faible dominant mais dose-dépendant. Nous privilégions la première option comme l’interprétation la plus directe et la plus simple.
Pour notre composante dans le projet CE-Biotechnologie, nous avons choisi d’utiliser des approches génétiques pour identifier le produit du gène de résistance sbm-1. Après avoir identifié des lignées de pois appropriées (une paire de lignées BC4 portant des allèles homozygotes de résistance et de susceptibilité), une stratégie ADNc-AFLP a été utilisée pour identifier les gènes exprimés provenant de la région introgressée. Jusqu’à présent, dix ADNc polymorphes ont été identifiés. Ils sont en cours de cartographie en utilisant des familles consanguines recombinantes pour confirmer leur origine génomique. Notre stratégie alternative consiste à » pêcher » le produit du gène sbm-1 en utilisant le système de levure à deux hybrides avec le PSbMV VPg comme protéine appât. Deux ADNc fortement candidats et huit autres ADNc codant pour des protéines d’interaction ont été identifiés à partir d’une bibliothèque d’ADNc de pois constituée à partir d’une lignée de pois sensible. Ces ADNc sont également en cours de séquençage et de cartographie.
Dans le cadre d’un précédent projet EC-AIR (# CT94-1171) impliquant des partenaires universitaires et industriels au Danemark, en France et au Royaume-Uni, nous avons également exploré le potentiel de développement de la PDR au PSbMV dans les pois transgéniques. Étant donné que dans d’autres systèmes, le gène de la réplicase virale a été couramment utilisé pour donner la PDR en déclenchant le processus d’extinction post-transcriptionnelle des gènes (PTGS), nous avons utilisé le cistron de la réplicase du PSbMV (NIb) pour l’expression transgénique dans les pois. A partir de 35 lignées de pois, transformées avec l’ADN-T d’Agrobacterium tumefaciens portant une construction promoteur 35S -Nib – terminateur 35S, et le gène bar comme marqueur de sélection des tissus transformés en présence de l’herbicide Bialophos, trois lignées se sont révélées résistantes au PSbMV. Deux de ces lignées portaient une répétition directe de l’extrémité 3′ du gène Nib (NIbIb), car il a été prouvé que les arrangements complexes de transgènes avaient plus de potentiel pour initier le PTGS. Toutes ces lignées présentaient un type de PDR appelé « récupération », où l’inoculation par provocation entraîne une infection initiale, mais les plantes se rétablissent rapidement et ne présentent plus de symptômes ni d’accumulation de virus. Les tissus récupérés sont alors résistants à une nouvelle provocation par des isolats de virus homologues ou étroitement apparentés. Pour évaluer l’importance de ce phénomène en plein champ où les plantes peuvent être confrontées à une population de virus apparentés, la capacité de différents isolats de PSbMV à déclencher la PTGS et à être ciblés par la PTGS induite a été évaluée. Cette évaluation a montré que les virus présentant une identité d’environ 89 % ou plus dans le cistron NIb pouvaient induire la résistance, bien que les exigences de spécificité pour qu’un second virus de provocation soit considéré comme une cible puissent être plus élevées. Pour référence, les deux isolats de PSbMV séquencés les plus divergents diffèrent de 89% dans la région Nib. Cette distinction dans les exigences de spécificité pour le déclenchement et le ciblage dans le PTGS sera une considération importante pour l’application de la technologie aux cultures commerciales. La résistance relativement large aux isolats de PSbMV dans les pois transgéniques Nib contraste avec l’extrême spécificité de pathotype observée pour les gènes de résistance naturelle de sbm où seulement un ou quelques changements dans le déterminant d’avirulence du virus est suffisant pour changer un isolat de PSbMV d’avirulent à virulent .
Malgré la courte période d’infection initiale, les plants de pois transgéniques ont montré une bonne croissance et une bonne montée en graines après l’inoculation de défi pour donner des rendements dans des conditions de serre équivalents à ceux observés pour les lignées transgéniques non infectées ou non transgéniques. Nous pensons que, sous réserve d’accords de licence couvrant l’utilisation du gène bar pour la sélection des plantes transformées, ces plantes pourraient être des ajouts utiles au panel de gènes de résistance aux pathogènes à utiliser pour développer de nouvelles lignées de pois améliorées.
Les plantes de pois transgéniques représentent les premières légumineuses affichant une PDR contre les potyvirus et certains des premiers exemples expérimentaux chez les Leguminosae de plantes montrant une PTGS. Il était donc utile d’établir que les principes régissant la PTGS et la résistance dans ce système étaient conformes à ceux caractérisés avec des plantes expérimentales plus couramment utilisées (par exemple Nicotiana spp.). Comme prévu pour la PTGS, la résistance induite au virus était associée à la dégradation de l’ARN du transgène et de l’ARN du PSbMV. Nous avons également montré que la PTGS était médiée dans ces plantes par un signal systémique généré pendant la phase initiale de l’infection virale, et que ce signal avait le potentiel de médier la propagation de la PTGS en induisant la méthylation dans la région transcrite du transgène NIb .
En conclusion, nous avons reconnu que l’industrie agricole bénéficierait d’avoir une résistance stable et efficace au PSbMV dans les pois. La voie la moins litigieuse pour y parvenir serait l’incorporation de résistances naturelles (soit à la transmission des graines, soit à la réplication du virus) en utilisant des stratégies de sélection conventionnelles. Notre compréhension relativement faible de la complexité génétique de la transmission du PSbMV par les graines signifie qu’il est peu probable que cela soit utile à court terme. Les gènes sbm- sont plus prometteurs bien que le manque de marqueurs génétiques étroitement liés et la nature récessive de la résistance créent certaines difficultés. Par ailleurs, nous avons démontré le potentiel de création de résistance par l’application de la technologie transgénique, mais les questions de biosécurité et d’acceptabilité par le public devront être abordées. En plus de ces considérations appliquées, la recherche a généré et génère encore des matériaux et des connaissances qui influenceront la façon dont les approches connexes peuvent être utilisées dans d’autres plantes cultivées. En particulier, il sera important de comprendre les mécanismes d’action d’une nouvelle classe de gènes de résistance aux virus.