Discussion
La présente étude a identifié un certain nombre de caractéristiques distinctes des CE et des SMC collatéraux qui peuvent sous-tendre ou contribuer aux caractéristiques uniques des collatéraux décrites dans l’introduction. Nous avons constaté que malgré la contrainte de cisaillement faible et oscillatoire présente dans les collatérales au départ en l’absence d’obstruction, leurs CE sont alignées avec l’axe du vaisseau au même degré que celui présent dans les artérioles les plus distales et l’aorte descendante – des vaisseaux avec un flux laminaire orthograde à grande vitesse. Les cellules endothéliales des collatérales et des artérioles possèdent des cils primaires, mais les collatérales en possèdent moins. Les cellules musculaires lisses des collatéraux sont continues, contrairement à celles des artérioles. Les collatérales présentent des niveaux d’expression plus élevés de gènes associés aux voies pro- et anti-inflammatoires et pro- et anti-prolifération, par rapport aux DMA. L’hypothèse d’un taux de prolifération cellulaire plus élevé dans les cellules murales des collatérales est étayée par l’observation que les collatérales commencent à acquérir une tortuosité peu après leur formation chez l’embryon, tortuosité qui augmente jusqu’à l’âge moyen (16 mois, 49 équivalents-années chez l’homme). Les résultats ci-dessus donnent un aperçu des spécialisations structurelles et moléculaires qui peuvent sous-tendre les caractéristiques et les fonctions uniques des vaisseaux collatéraux.
La convergence du flux sanguin dans les collatéraux au départ impose des forces de contrainte de cisaillement/flux faibles et « perturbées » sur leurs cellules murales, c’est-à-dire soit l’absence de flux, soit un flux très faible qui oscille dans les deux sens (~1-10 fois par minute) et dont la moyenne est nulle . Il en résulte une augmentation de la contrainte sur la paroi selon la relation de Bernoulli. Lorsqu’elle est présente ailleurs dans la circulation artérielle, par exemple au niveau des bifurcations, de la voûte interne de l’aorte ou en aval des plaques, une contrainte de cisaillement faible et perturbée favorise une morphologie de CE non alignée et pavée qui est associée à une augmentation du stress oxydatif, de l’inflammation, des marqueurs du vieillissement et à une faible activité eNOS/NO (c’est-à-dire un dysfonctionnement endothélial). Cependant, de façon surprenante, nous avons constaté que les CE collatérales ont le même alignement (et les mêmes dimensions cellulaires) que les CE dans les DMA et l’aorte descendante. Nous n’avons pas étudié comment ce phénotype structurel anti-inflammatoire est spécifié. Il est possible qu’une ou plusieurs des autres caractéristiques uniques que nous avons identifiées soient impliquées (voir ci-dessous). D’autre part, les données de la figure 2 pour le débit et la contrainte de cisaillement ont été obtenues chez des animaux anesthésiés. Pendant les comportements éveillés, les collatérales peuvent avoir des périodes de débit soutenu dans l’une ou l’autre direction, induites par des changements de l’activité métabolique régionale dans le territoire alimenté par les arbres artériels qu’elles croisent. On ne sait pas si les collatérales contribuent de cette manière à la régulation métabolique physiologique du débit sanguin et de l’apport en oxygène, c’est-à-dire au couplage neurovasculaire dans le cerveau et à l’hyperémie fonctionnelle ailleurs. Cependant, de telles périodes de flux unidirectionnel soutenu pourraient favoriser l’orientation des CE que nous avons observée. Indépendamment de la cause sous-jacente, nous spéculons que le phénotype aligné des CE collatérales fait partie (ou est un marqueur) d’un groupe de mécanismes de protection qui favorisent le maintien des collatérales et atténuent leur raréfaction (figure 9).
À notre connaissance, il s’agit du premier rapport montrant que les CE qui tapissent les collatérales et les artérioles possèdent des cils primaires. Ils sont beaucoup plus abondants que ce qui avait été rapporté précédemment pour les vaisseaux de conduit d’individus sains (c’est-à-dire absents ou présents sur moins de 1 % des CE) : 18 % des CE collatéraux ont des PrC contre 28 % pour les DMA. Les cils primaires sur les CE ont été décrits en 1984 par Haust dans l’aorte de lapins et d’humains atteints d’athérosclérose. Des rapports ultérieurs ont décrit des CE ciliés dans les capillaires de la glande pinéale d’un fœtus humain de 20 semaines, dans le cœur en développement et dans les feuillets de la valve aortique (et références à ces documents), autour des athéromes, de manière ectopique dans l’artère carotide commune de souris ApoE-/-, et chez des individus sains au niveau des bifurcations des artères de conduit et de la courbure interne de l’arc aortique ; en revanche, les cils sont absents ou presque dans les régions des artères où la contrainte de cisaillement est laminaire. La plupart des autres types de cellules expriment la PrC au cours du développement, dans certaines conditions de culture cellulaire et chez l’adulte. Selon le type cellulaire, les PrC participent à la spécification de l’asymétrie de l’embryon, à la disposition des centrioles, à la régulation de la prolifération et du cycle cellulaire, à l’autophagie, à la mécanotransduction par détection de flux, à la chimioception, ainsi qu’à la compartimentation et au trafic des protéines de signalisation entre le cilioplasme, le cytoplasme et le nucléoplasme (par exemple, pour Gli et PDGFRα). Lorsqu’ils sont présents, les cils sont plus abondants dans les cellules non proliférantes, l’extrémité proximale étant ancrée dans une invagination du plasmalemme (poche ciliaire) dans les CE et d’autres types de cellules, mais pas tous . Les cils primaires sont complexés avec le centriole mère du corps basal qui est relié au centre d’organisation des microtubules (MTOC). Le désassemblage/la résorption du cilium pendant la phase S et la libération du centriole sont essentiels à la division cellulaire. Étant donné que les PrC sont liés au cytosquelette par le MTOC, la flexion ciliaire induite par l’écoulement dans les CE est capable d’être transmise dans toute la cellule, y compris aux jonctions cellule-cellule et cellule-matrice. Les cils primaires transmettent la contrainte de cisaillement des fluides dans les cellules épithéliales tubulaires rénales et les CE par une voie qui est exceptionnellement sensible à la contrainte de cisaillement et qui implique la polycystine-1 et la polycystine-2, qui sont codées par Pkd1 et Pkd2 . La polycystine-1 a des propriétés mécanosensibles tandis que la polycystine-2 est un canal calcique TRP. Les deux protéines sont nécessaires pour détecter la contrainte de cisaillement et libérer à leur tour de l’oxyde nitrique. Les défauts de la PrC sont associés à de nombreuses anomalies. Par exemple, les mutations de PKD1 et PKD2 sont responsables de la maladie polykystique rénale autosomique dominante, les CE rénales et les cellules tubulaires des patients présentant des réponses déficientes au calcium et au NO et une prolifération accrue .
Les cils primaires sont absents dans les CE des veines ombilicales humaines maintenues sous contrainte de cisaillement laminaire et en quiescence proliférative en culture cellulaire. Dans les veines ombilicales humaines, moins d’un pour cent des CE ont des cils qui font saillie dans la lumière, tandis que dans une fraction plus importante, les cils sont situés de manière intracellulaire . L’aorte embryonnaire et les CE cultivés à partir de celle-ci possèdent un seul cilium qui fait saillie dans la lumière. Les cils endothéliaux sont présents dans les régions à forte contrainte de cisaillement pendant le développement embryonnaire, de même que l’expression du facteur de transcription KLF2, sensible à la contrainte de cisaillement, qui transactive la eNOS et d’autres gènes anti-inflammatoires et anti-prolifératifs. Dans les régions où la contrainte de cisaillement est faible ou perturbée, les PrC sont désassemblés/absents et l’expression de Klf2 et d’eNOS est abolie et réduite, respectivement. L’expression de Klf2 est également inhibée dans les CE non ciliées isolées d’artères embryonnaires, et l’élimination chimique des PrC des CE en culture a un effet similaire, à savoir l’abolition de l’expression de Klf2 . Il est intéressant de noter que dans les CE de souris adultes ApoE-/-, qui présentent un dysfonctionnement endothélial mais ne développent pas de plaques, les cils sont exprimés de manière ectopique dans l’artère carotide commune malgré la présence d’un flux laminaire, par rapport aux souris sauvages qui sont dépourvues de cils. Les cils ont disparu lorsque des contraintes de cisaillement élevées ont été induites par l’implantation d’un moulage limitant le flux autour du vaisseau. L’implantation de carotides communes chez des souris de type sauvage n’a induit une ciliogenèse que dans les régions où la contrainte de cisaillement est faible et perturbée. Ces résultats suggèrent que l’expression de la PrC sur les CE in vivo chez les adultes est limitée aux régions où la contrainte de cisaillement est faible/perturbée, mais qu’elle peut se produire de manière ectopique dans les artères à flux laminaire en présence d’une dysfonction endothéliale causée par l’hyperlipidémie et peut-être d’autres facteurs de risque vasculaire. À noter que dans les zones à écoulement perturbé fortement ciliées, telles que la courbure interne de la voûte aortique ou en aval des plaques, environ 25 % des CE ont un seul cilium tandis que le reste en est dépourvu , un pourcentage similaire à ce que nous avons observé dans les artérioles et les collatérales.
Nos constatations que les PrC sont également présents sur les artérioles et les collatéraux chez les jeunes souris adultes saines soulignent la nécessité d’études examinant la fonction des cils dans ces types de vaisseaux. Il s’agit notamment de déterminer si notre observation d’un nombre inférieur de cils sur les CE des collatérales par rapport aux artérioles a une signification fonctionnelle. Les cellules endothéliales sont couplées mécaniquement, électriquement et par diffusion aux CE et aux SMC adjacentes, de sorte que seule une fraction des CE peut avoir besoin d’exprimer des cils pour la transduction de signaux mécanosensibles ou autres. Une forte contrainte de cisaillement entraîne le désassemblage des cils dans les CE en culture, tandis que l’inversion oscillatoire du flux induit leur expression. Nous supposons que les cils sur les artérioles et les CE collatérales peuvent refléter le faible débit/contrainte de cisaillement dans les artérioles et le débit très faible et perturbé dans les collatérales et que moins de PrC sur les CE collatérales peuvent servir à réduire leur sensibilité à l’environnement de contrainte de cisaillement perturbé qui prévaut. En d’autres termes, la diminution du nombre de cils sur les CE collatérales peut faire partie d’un répertoire d’adaptations qui s’équilibrent ou s’opposent – par le maintien ou l’augmentation de l’expression de KLF2/4, de eNOS et d’autres facteurs anti-inflammatoires/anti-prolifératifs – aux signaux inflammatoires, oxydatifs, prolifératifs et apoptotiques de bas grade favorisés par l’environnement hémodynamique perturbé présent dans les collatérales (Figure 9). Egorova et al. ont proposé quelque chose de similaire, c’est-à-dire que puisque la présence de PrC sur les CE est associée à l’expression de KLF2, les cils endothéliaux peuvent signaler un frein à l’activation des CE dans les régions où le débit est faible et perturbé. L’hypothèse d’un rôle protecteur des cils dans ces régions est étayée par le rapport récent selon lequel l’élimination des cils endothéliaux par délétion conditionnelle d’Ift88 augmente l’athérosclérose et l’expression des gènes inflammatoires, et diminue l’activité de la eNOS chez les souris Apoe-/- soumises à un régime riche en graisses, et selon lequel l’endothélium est sensibilisé, dans les régions sujettes à l’athérome, à la différenciation ostéogénique chez les souris Tg737 (orpk/orpk) déficientes en cils. Il est également possible que si les PrC sont protecteurs, leur nombre moindre dans les collatéraux pourrait contribuer à la grande sensibilité de ces vaisseaux à la raréfaction due au vieillissement et à d’autres facteurs de risque vasculaire. Cependant, la diminution du nombre de cils dans les collatérales pourrait simplement refléter un effet secondaire ou secondaire, étant une conséquence, par exemple, d’un taux de prolifération inhérent plus élevé des CE des collatérales, comme le montre l’augmentation progressive de la tortuosité des collatérales (discutée ci-dessous), puisque la présence de PrC et leur association avec le corps basal est censée favoriser le retrait des cellules du cycle cellulaire . Des études futures seront nécessaires pour déterminer si notre constatation de cils multiples sur les CE reflète les CE qui ont subi une sénescence proliférative et associée à un échec de la cytokinèse et de la polyploïdie nucléaire .
Il a récemment été démontré que les CE dans la rétine de la souris en développement comptent sur le PrC pour stabiliser les connexions des vaisseaux pendant le remodelage du plexus vasculaire dans les régions avec une contrainte de cisaillement faible à intermédiaire . Les cils endothéliaux détectent l’écoulement dans les embryons de poisson zèbre, participent au recrutement des cellules murales dans les vaisseaux artériels et sont nécessaires à la morphogenèse vasculaire normale. Le nombre et le diamètre des collatérales diminuent à partir de l’âge moyen. Cette raréfaction due à l’âge est fortement accélérée par une déficience génétique ou pharmacologique en eNOS/NO ou par la présence de facteurs de risque vasculaire. L’augmentation de la contrainte de cisaillement induit un remodelage des collatérales vers l’extérieur à la suite d’une obstruction artérielle aiguë ou à évolution lente. Les souris Pkd1+/- et les patients atteints de la polykystose rénale autosomique dominante présentent un dysfonctionnement endothélial de la eNOS/NO. Il sera important d’examiner dans de futures études si les PrC collatéraux participent à une ou plusieurs des fonctions ci-dessus en utilisant le knockdown spécifique des CE de la polycystine-1, car : 1) sa déficience entraîne une altération de la fonction ciliaire, 2) la polycystine-1 et la polycystine-2 participent à la détection du flux par les PrC, 3) les formes mutantes de l’une ou l’autre des protéines provoquent la polykystose rénale, 4) il existe des preuves que VHL, indépendamment de son rôle dans la dégradation de Hif1α, ainsi que GSK3β sont nécessaires au maintien structurel du cilium, et 5) la protéine Rabep2, qui est nécessaire à la collatérogenèse, est un nouveau substrat de GSK3β, se localise au complexe cilium-corps basal, et son knockdown entraîne une ciliogenèse défectueuse. D’autres approches pour interférer avec la présence et la fonction des cils, par exemple, avec le knockdown d’autres protéines ciliaires telles que Pkd2 et Ift88, devront également être examinées.
Contrairement aux artérioles distales, qui ont des SMC éparses et discontinues dans divers tissus, y compris la rétine (nous n’avons pas été en mesure d’identifier des études dans le cerveau) , les SMC étaient continues sur les collatérales. Nous pensons qu’il s’agit peut-être d’une augmentation adaptative de l’épaisseur de la paroi pour équilibrer l’augmentation de la contrainte circonférentielle de la paroi causée par la conversion, spécifiée par Bernoulli, de l’énergie cinétique du flux en énergie potentielle accrue (pression transmurale), conséquence de la convergence du flux dans les collatérales. Il serait intéressant d’examiner si la composition et la quantité de la matrice extracellulaire, qui pourrait aider les SMC à équilibrer la contrainte accrue sur la paroi dans les collatéraux, diffèrent dans les collatéraux et les artérioles. Il convient de noter que, malgré leur couverture accrue de SMC, les collatéraux ont moins de tonus que les artérioles de taille similaire, et manquent de réactivité myogénique – des caractéristiques uniques supplémentaires des vaisseaux collatéraux.
L’environnement hémodynamique perturbé et pro-oxydant dans lequel résident les cellules murales collatérales nous a conduit à examiner si l’expression des gènes impliqués dans l’inflammation, la prolifération cellulaire, le vieillissement et l’angiogenèse diffère pour les collatéraux par rapport aux artérioles distales. Les collatérales présentaient des niveaux accrus d’ARNm pour le gène de l’inflammasome pro-inflammatoire et pro-apoptose, Pycard, les gènes pro-prolifératifs, Ki67, Pdgfb et Angpt2, le gène anti-prolifératif, Dll4, et le gène marqueur des CE différenciées de type artériel, Ephrinb2. En revanche, l’expression des gènes inhibiteurs du cycle cellulaire, p21, p27 et p53, n’était pas différente, ni celle d’autres gènes associés à la prolifération, à l’arrêt du cycle cellulaire et au vieillissement (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, télomérase). Il n’y avait pas non plus de différences dans l’expression d’autres gènes associés à la prolifération des CE et/ou des SMC (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) et qui sont requis (dans le cas des trois premiers gènes) pour la formation des collatérales pendant le développement ou impliqués dans la spécification de la différenciation et de la quiescence des CE et des SMC (Tgfb, Angpt1). L’expression accrue par les collatérales des gènes pro-prolifération ci-dessus est cohérente avec nos mesures de tortuosité, qui suggèrent que les cellules murales collatérales ont un taux de prolifération plus élevé, par rapport aux autres vaisseaux artériels : la tortuosité collatérale était évidente dès le premier jour après la naissance, a continué à augmenter jusqu’à l’âge moyen, puis a diminué. La tortuosité des collatérales était évidente dès le premier jour après la naissance, elle a continué à augmenter jusqu’à l’âge moyen, puis a diminué. Ces résultats appuient l’hypothèse selon laquelle la raréfaction des collatérales associée à l’âge est causée par la sénescence proliférative et l’apoptose subséquente des CE et des SMC collatérales en raison d’une élévation à vie du taux de prolifération causée par l’environnement hémodynamique perturbé et à faible teneur en oxygène sanguin dans lequel résident les collatérales (figure 9).
Les collatérales présentaient également une activité accrue de la eNOS, dont des études antérieures ont montré qu’elle s’oppose à la raréfaction des collatérales causée par le vieillissement et d’autres facteurs de risque vasculaire . Le NO dérivé de la eNOS inhibe le stress oxydatif, l’inflammation, la prolifération, l’adhésion des leucocytes, l’agrégation plaquettaire et le vieillissement cellulaire et favorise la relaxation des SMC . Comme la contrainte de cisaillement est un stimulus immédiat pour le NO dérivé de la eNOS, une augmentation de la eNOS/NO dans les collatérales avec leur environnement de contrainte de cisaillement faible et perturbé peut atténuer l’effet des facteurs favorisant la raréfaction des collatérales (Figure 9). De même, le maintien de l’expression des facteurs de transcription sensibles à la contrainte de cisaillement des CE, Klf2 et Klf4, dans les collatérales malgré leur débit faible et oscillant, qui inhibe l’expression de ces facteurs ailleurs dans le système vasculaire artériel avec un débit perturbé, peut agir comme des facteurs » équilibrants » supplémentaires ou des spécialisations collatérales, avec l’augmentation de la eNOS, l’alignement des CE, la diminution des cils, la couverture robuste des SMC et l’augmentation de l’ephrine-B2 et de la Dll4. L’expression de KLF2 et KLF4, qui régulent négativement la prolifération, l’inflammation et l’angiogenèse, régulent à la hausse la eNOS et sont fortement régulés à la baisse aux sites de contraintes de cisaillement faibles et perturbées, n’était pas différente dans les collatérales et les DMA. Il est intéressant de noter que le PrC favorise l’expression de Klf2, Klf4 et eNOS.
L’une des limites des études ci-dessus est que l’ARN a été obtenu à partir de vaisseaux disséqués, qui sont composés de CE, de SMC et, bien que moins, de péricytes, de fibroblastes et de cellules myéloïdes résidentes. Des études sont nécessaires pour séparer les types de cellules et examiner un plus grand nombre de gènes et leurs niveaux de protéines respectifs. Cependant, la difficulté de disséquer manuellement les collatérales et les artérioles distales en nombre suffisant, l’effet des techniques de dissociation cellulaire sur les niveaux de base d’ARN et de protéines, l’absence de modèles de culture cellulaire de CE et de SMC « collatérales », et l’absence jusqu’à présent de tout gène marqueur spécifique des collatérales, empêchent l’utilisation de ces approches. Il convient toutefois de noter que l’expression de plusieurs des gènes examinés est spécifique ou enrichie pour les CE, par exemple, Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 et Klf4. Cependant, l’analyse de la transcription des gènes ne reflète pas toujours les changements au niveau des protéines ou de la fonction ; ainsi, l’étude des marqueurs de stress oxydatif, inflammatoires, de prolifération ou de sénescence au niveau des protéines peut mieux refléter les différences dans les caractéristiques cellulaires.