Abstract
La dérivation d’un modèle quantitatif du métabolisme de la phénylalanine chez l’homme est décrite. Le modèle est basé sur les propriétés cinétiques de la phénylalanine hydroxylase humaine recombinante pure et sur des estimations des taux in vivo de transamination de la phénylalanine et de dégradation des protéines. Les valeurs calculées pour la concentration de phénylalanine dans le sang à l’état d’équilibre, la vitesse d’élimination de la phénylalanine du sang après une charge orale de l’acide aminé et la tolérance alimentaire de la phénylalanine concordent toutes avec les données provenant de sujets normaux, de patients phénylcétonuriques et d’hétérozygotes obligatoires. Ces valeurs calculées peuvent aider à décider du degré de restriction de l’apport en phénylalanine qui est nécessaire pour obtenir un résultat clinique satisfaisant chez les patients classiques et chez ceux qui présentent des formes plus légères de la maladie.
L’étape initiale et limitant la vitesse du catabolisme complet de la phénylalanine en CO2 et en eau est son hydroxylation en tyrosine, une réaction catalysée par le système d’hydroxylation de la phénylalanine. Ce système est complexe et se compose de la phénylalanine hydroxylase (PAH), de la tétrahydrobioptérine (BH4), une coenzyme de la ptérine, et de plusieurs enzymes qui servent à régénérer la BH4, à savoir la dihydroptéridine réductase et la ptérine 4α-carbinolamine déshydratase (1, 2).
Bien que le noyau benzénique de la phénylalanine ne puisse être rompu sans avoir été préalablement hydroxylé en position para, la chaîne latérale alanine de l’acide aminé peut être métabolisée même en l’absence de l’étape d’hydroxylation du noyau. Cette autre voie est initiée par la transamination de la phénylalanine en phénylpyruvate, suivie de la conversion de ce dernier composé en métabolites tels que le phényllactate, le phénylacétate et l’o-hydroxyphénylacétate. Les produits de la voie de la transaminase sont excrétés dans l’urine. Les étapes de ces voies alternatives du métabolisme de la phénylalanine sont décrites dans la figure 1.
D’emblée, il convient de noter qu’une tentative antérieure d’effectuer une telle analyse a été handicapée par le manque de données sur les propriétés cinétiques de la HAP humaine et de la phénylalanine transaminase humaine. En effet, pour cette dernière enzyme, même l’identité de celle qui est responsable de cette activité in vivo n’était pas connue avec certitude. Comme les données in vitro indiquaient que la phénylalanine est un excellent substrat pour l’aspartate aminotransférase mitochondriale, on a supposé qu’il s’agissait de la transaminase en cause. En outre, les propriétés de l’homologue humaine n’étant pas connues, on a utilisé les propriétés cinétiques de l’enzyme correspondante chez le rat (12). La façon dont le problème de la transaminase humaine a été traité dans la présente analyse sera discutée ci-dessous.
Les propriétés cinétiques de la PAH humaine recombinante sont maintenant disponibles (16, 17). La cinétique de la PAH est quelque peu compliquée par le fait que la phénylalanine sert non seulement de substrat pour l’enzyme, mais aussi d’activateur (voir réf. 1 et les références qui y figurent). Une analyse précédente du comportement cinétique de la PAH basée sur un modèle à deux sites avec une liaison ordonnée de la phénylalanine à la fois sur le site catalytique et sur le site régulateur a permis de rendre compte de manière adéquate de nombreux aspects particuliers du comportement cinétique de l’enzyme (18), c’est pourquoi un modèle similaire à deux sites et à liaison ordonnée a été utilisé dans la présente analyse. L’équation de vitesse réelle utilisée (19) est présentée dans l’équation 2, où Km est la concentration de phénylalanine qui donne une vitesse semi-maximale et Ka est la concentration de phénylalanine qui donne une activation semi-maximale dans une expérience dans laquelle le PAH a été pré-incubé avec des concentrations variables de phénylalanine. Pour la présente analyse, les constantes cinétiques suivantes, déterminées avec du PAH humain recombinant pur à 37°C avec du BH4 comme coenzyme, ont été utilisées : Km pour la phénylalanine, 0,51 mM, et Ka pour la phénylalanine comme activateur, 0,54 mM (D. Kowlessur et S.K., données non publiées). Une valeur approximative de Vmax pour l’HTAP humaine (16) (probablement une sous-estimation) a été calculée à partir de la vitesse initiale de diminution des taux sériques de phénylalanine (0,9 μmol/ml par h) chez des sujets témoins après qu’ils aient reçu une charge orale de l-phénylalanine suffisante pour augmenter leurs taux sériques de phénylalanine d’un facteur ≈17 (20). 
2 Comme indiqué ci-dessus, le problème précédent de l’identité de l’enzyme chez l’homme qui est responsable de la transamination de la phénylalanine a été contourné dans la présente analyse. On a supposé que la voie principale pour l’élimination nette de la phénylalanine chez les patients atteints de PCU classique est la transamination. Par exemple, comme nous l’avons déjà mentionné, l’excrétion urinaire de la phénylalanine ne représente que ≈11 % de la quantité transaminée et, à la fin de la première année de vie, on peut estimer que la quantité de phénylalanine éliminée par incorporation dans les protéines ne représente que ≈25 % de celle éliminée par transamination. Il faut noter qu’avec la méthode actuelle d’estimation du taux de phénylalanine transaminase, qui est basée sur le taux de clairance de la phénylalanine dans le sang, les réactions mineures d’élimination de la phénylalanine, comme son excrétion urinaire et son incorporation dans les protéines, sont subsumées dans l’estimation de l’activité de la transaminase, ce qui entraîne une légère surestimation de cette activité.
Pour être utiles dans la présente analyse, des valeurs pour le Km et le Vmax de la transaminase sont nécessaires. Des tentatives ont été faites pour extraire une valeur de Km pour la transamination de la phénylalanine à partir des résultats de tests de charge en phénylalanine effectués sur des patients atteints de PCU classique (21). L’approche adoptée pour estimer une valeur de Vmax pour l’enzyme transaminante humaine a été d’utiliser les données sur la somme de tous les métabolites dérivés de la transamination (c’est-à-dire le phénylpyruvate, le phényllactate et l’o-hydroxyphénylacétate) excrétés par un groupe de patients atteints de PCU classique en fonction de leurs niveaux de phénylalanine dans le plasma. La quantité maximale excrétée, exprimée en mmol/mol de créatinine, était de 1 370, un niveau qui semblait atteindre un plateau à des niveaux de phénylalanine plasmatique compris entre 1 200 et 2 400 μmol/litre (22).
Les tentatives de conversion de cette valeur en un taux de transamination sont compliquées par la large gamme d’âges, ≈2 ans à ≈18 ans, dans l’échantillon de patients utilisé dans l’étude. Pour la présente analyse, il a été supposé que le poids corporel moyen des patients était de 50 kg et que l’excrétion quotidienne de créatinine était de 2 g/24 h (23). Il a également été supposé que l’excrétion des métabolites dérivés de la transaminase se produit à un taux linéaire pendant la période de 24 heures et reflète le taux de formation de ces métabolites. On a également supposé que ces composés s’équilibrent avec tous les compartiments de liquides corporels, à l’exception du tissu conjonctif dense du cartilage et de l’os, qui, ensemble, représentent 15 % de l’eau corporelle totale (24), ce qui donne un volume de distribution de l’eau accessible de 500 ml/kg de poids corporel. Sur la base de ces hypothèses, le taux maximal de transamination a été calculé à 0,043 μmol/ml par h.
Un produit supplémentaire du métabolisme de la phénylalanine qui est dérivé, au moins en partie, du phénylpyruvate et qui n’a pas été mesuré dans l’étude de Langenbeck et al. (22) est la phénylacétylglutamine (PAG). Il existe des preuves que la PAG peut être formée à partir du phénylacétate, qui est dérivé du phénylpyruvate par décarboxylation oxydative (25). Il a également été proposé que le phénylacétate et, par conséquent, le PAG, puissent être formés à partir de la phénylalanine par une voie qui n’implique pas de transamination, mais plutôt une décarboxylation en phényléthylamine suivie d’une oxydation de l’amine en phénylacétate (26). La constatation que la quantité de phényléthylamine excrétée chez les patients atteints de PCU est faible même après que l’oxydation de l’amine ait été bloquée par l’administration d’un inhibiteur de l’amine oxydase (27), indique cependant que, comme discuté précédemment (12), la décarboxylation de la phénylalanine est une voie quantitativement mineure pour le métabolisme de la phénylalanine, ainsi que pour la formation de PAG.
La quantité de PAG excrétée par les individus normaux est de 250-500 mg/jour ; les patients atteints de PCU excrètent deux fois cette quantité (28). Dans le but de calculer la quantité de PAG formée par la voie de la transaminase, l’hypothèse conservatrice a été faite que seule la quantité « supplémentaire » excrétée par les patients est dérivée du phénylpyruvate. En prenant la quantité supplémentaire moyenne de PAG excrétée comme étant de 350 mg/jour et en faisant les mêmes hypothèses que celles décrites ci-dessus, cette excrétion se traduit par un taux de formation de PAG de 0,020 μmol/ml par h, ce qui porte le taux de formation de tous les produits transaminés à 0,063 μmol/ml par h.
Avec l’utilisation de cette valeur pour le Vmax, les résultats du test de charge en phénylalanine effectué sur des patients atteints de PCU classique (21) ont été utilisés pour calculer une valeur de 1.37 ± 0,14 mM (moyenne ± SD, n = 3) pour le Km de la phénylalanine transaminase.
Parce que dans la présente analyse, les activités PAH et transaminase sont calculées en fonction des taux sanguins de phénylalanine, il est important que ces taux reflètent les taux tissulaires de l’acide aminé. En rapport avec ce point, on a signalé que les niveaux de phénylalanine dans les tissus hépatiques d’un patient atteint de PCU (29), ainsi que dans les tissus hépatiques et rénaux de rats hyperphénylalanémiques (30), sont comparables aux niveaux correspondants dans le sang.
Le troisième terme de l’équation 2, le taux de dégradation nette des protéines, a été estimé à partir des données de Waterlow et Jackson (31), montrant qu’à l’état de jeûne, état dans lequel est effectué le test de charge en phénylalanine, la dégradation nette des protéines (c’est-à-dire, la quantité de protéines dégradées moins la quantité synthétisée) est égale à 0,30 g/kg de poids corporel par 12 h. Parce que le muscle squelettique constitue ≈40% de la masse corporelle (24) et que le catabolisme protéique dans ce tissu joue un rôle majeur dans la livraison d’acides aminés à la périphérie, la dégradation des protéines dans le muscle squelettique a été prise comme l’événement prédominant dans la dégradation des protéines qui se produit pendant le jeûne.
Le muscle squelettique humain contient ≈46 μmol de phénylalanine/g de tissu (32). Sur la base de cette valeur et du constat que le muscle humain adulte contient 19,8 % de protéines (33), on peut estimer que le muscle contient 232 μmol de phénylalanine/g de protéines musculaires. Si cette valeur est considérée comme représentative des réserves protéiques de l’organisme, elle indiquerait que ≈70 μmol de phénylalanine/kg de poids corporel par 12 h seraient libérés pendant la période de jeûne. Sur la base des mêmes hypothèses que celles formulées ci-dessus pour estimer le taux de transamination de la phénylalanine, cette dernière valeur se traduirait par un taux horaire de dégradation nette des protéines (et de libération de la phénylalanine par ce processus) de 0,012 μmol/ml par h. Comme le substrat de cette réaction, à savoir les réserves corporelles de protéines, resterait probablement relativement constant pendant une courte période de jeûne, la dégradation des protéines a été supposée suivre une cinétique d’ordre zéro.
Substituer les valeurs estimées pour les constantes cinétiques des trois réactions indiquées dans l’équation 1 donne l’équation 3 : 
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RESULTATS ET DISCUSSION
La validité générale de l’équation 3 peut être évaluée de plusieurs façons. Tout d’abord, avec l’utilisation de l’expression de la vitesse de la réaction catalysée par les HAP, y compris les constantes cinétiques indiquées dans l’équation, le taux basal de la réaction d’hydroxylation a été calculé pour être de 0,010 μmol/ml par h. Cette valeur concorde bien avec les valeurs suivantes rapportées pour des sujets normaux sur la base d’expériences au cours desquelles des sujets ont été perfusés avec de la l-phénylalanine : 0,013 μmol/ml par h ; 0,008 μmol/ml par h (34) ; 0,012 μmol/ml par h (5) ; 0,010 μmol/ml par h (6). Une valeur de 0,020 μmol/ml par h a été trouvée dans la dernière étude lorsque les sujets ont été perfusés avec de la l-phénylalanine (6). Les taux in vivo cités pour la conversion de la phénylalanine en tyrosine ont tous été rapportés en μmol/h par kg. Ils ont été convertis en μmol/ml par h sur la base des mêmes hypothèses que celles utilisées précédemment, à savoir que le volume de distribution des métabolites tels que la phénylalanine est de 500 ml/kg de poids corporel. Ces résultats montrent que le taux calculé d’hydroxylation de la phénylalanine concorde bien avec les taux déterminés expérimentalement.
Un autre test de la validité du modèle consiste à calculer le taux sanguin de phénylalanine à l’état d’équilibre à la fois pour les sujets témoins et pour les hétérozygotes PKU qui sont supposés avoir 50 % de l’activité normale de la PAH, ainsi que le t1/2 pour la clairance d’une charge de phénylalanine (c’est-à-dire, le temps nécessaire pour que la concentration initiale de phénylalanine diminue jusqu’à la moitié de sa valeur initiale) dans le sang pour ces deux groupes. Le taux de phénylalanine à l’état d’équilibre pour les témoins, calculé à partir de l’équation 3 (en mettant le terme « -dPhe/dt » égal à zéro et en calculant la concentration de phénylalanine), est de 0,059 mM et celui des sujets présentant une activité résiduelle d’HAP de 50 % est de 0,079 mM, soit 1,34 fois plus élevé que le taux des témoins. Bien que la valeur de 0,059 mM pour les sujets normaux corresponde bien à la valeur acceptée de 0,058 ± 0,015 mM (moyenne et écart-type) (35), la valeur de 0,079 mM pour les hétérozygotes, dont on peut s’attendre à ce qu’ils aient 50 % du niveau normal d’HAP, semble trop faible. Le rapport des niveaux de phénylalanine dans le sang pour les contrôles et pour les hétérozygotes obligatoires de la PCU a été rapporté comme étant dans la gamme de 1,57-1,61 (36-38) plutôt que le rapport de 1,34 qui a été prédit par le modèle.
Cette valeur calculée soulève la possibilité que les hétérozygotes de la PCU puissent avoir moins de 50% de l’activité PAH de contrôle. En substituant une valeur de 40 % de l’activité PAH témoin pour les hétérozygotes dans l’équation 3, on obtient une concentration de phénylalanine à l’état d’équilibre de 0,093 mM ; en utilisant cette valeur et la valeur de 0,058 mM pour les témoins, on obtient un rapport de 1,60, qui est proche de la fourchette rapportée pour les hétérozygotes et les témoins (voir ci-dessus). À cet égard, il convient de noter que l’activité résiduelle des HAP dans les échantillons de biopsie hépatique trouvés pour six hétérozygotes obligatoires de l’HPA se situait entre 5,8 et 31 % des valeurs de contrôle (39). Ces résultats ont fourni la première indication que les hétérozygotes HPA ont une activité significativement inférieure à 50 % des valeurs de contrôle. Deux études ultérieures plus importantes de parents de patients atteints de PCU étaient en accord avec ces résultats antérieurs : une étude a rapporté une valeur moyenne de 29,3 % des contrôles (n = 9) (40) et une autre a rapporté une valeur moyenne de 28,1 % (n = 8) (41).
Le modèle prédit également des valeurs de t1/2 pour la clairance de la phénylalanine du sang pour les normaux et les hétérozygotes qui sont en accord avec les résultats cliniques réels. Pour les normaux, une valeur de 65 min est obtenue, ce qui est inférieur à la valeur moyenne rapportée de 89 min mais bien dans la fourchette de 60-120 min (10). Pour les hétérozygotes avec une activité HPA résiduelle de 50 et 40 %, les valeurs de t1/2 calculées à partir de l’équation 3 sont de 144 et 180 min, respectivement, par rapport à une valeur moyenne rapportée de 159 min .
On a déjà fait référence à un rapport de deux patients HPA dont l’incapacité à métaboliser la phénylalanine semblait être le résultat d’un déficit en transaminase (11) et aux preuves contre cette conclusion (12). Le présent modèle fournit une raison supplémentaire de considérer cette affirmation avec scepticisme. La figure 2 montre l’évolution temporelle de la disparition de 1 mM de phénylalanine du plasma d’un sujet témoin (courbe A) et d’un sujet déficient en transaminase mais présentant des niveaux normaux d’HAP (courbe B). Comme on peut le voir, les deux taux sont presque identiques, ce qui rend extrêmement improbable qu’une HPA prononcée puisse être causée par un manque de transaminase. La raison de la quasi-identité des deux taux est que le taux de disparition de la phénylalanine en l’absence totale de HAP (courbe D) est très faible, le taux initial n’étant que de 2,6% de celui d’un contrôle avec des niveaux normaux de HAP. La figure 2 (courbe C) montre également le taux d’élimination de la phénylalanine chez un individu présentant 40 % du taux normal de PAH, un déficit d’activité de la PAH qui, comme nous l’avons vu plus haut, pourrait représenter la moyenne des hétérozygotes PKU.
Taux calculés de clairance d’une charge de phénylalanine pour des témoins et pour des individus avec différents génotypes. A, témoins ; B, sujet avec une activité transaminase nulle ; C, sujet avec une activité HAP de 40% du contrôle ; D, sujet avec une activité HAP de 0% du contrôle.
Récemment, les patients atteints de PCU ont été classés en les assignant à des catégories de phénotypes sur la base de leur tolérance à la phénylalanine alimentaire. Les patients atteints de PCU classique tolèrent moins de 20 mg/kg de phénylalanine par jour pour maintenir leur taux sanguin de phénylalanine au niveau accepté de 0,3 mM, ceux atteints de « PCU modérée » tolèrent 20-25 mg/kg par jour et ceux atteints de « PCU légère » tolèrent 25-50 mg/kg par jour (42).
Pour voir si ces valeurs de tolérance à la phénylalanine alimentaire sont cohérentes avec les prédictions faites par l’équation 3, on a supposé que l’apport de la quantité autorisée de phénylalanine était divisé de manière égale en trois « repas ». Pour les patients atteints de PCU classique avec une consommation de phénylalanine de 15 mg/kg par jour, chaque repas contiendrait 5 mg/kg par jour et ajouterait 0,06 μmol/ml à la valeur de base de 0,30 μmol/ml, pour un taux plasmatique total de phénylalanine de 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. En substituant cette valeur dans l’équation 3 (en supposant que le Vmax d’un patient atteint de PCU classique est égal à zéro), -dPhe/dt est égal à 0,001 μmol/ml par h, c’est-à-dire qu’à ce niveau de phénylalanine, la vitesse de disparition de la phénylalanine via la réaction de transamination dépasse à peine la vitesse d’entrée de la phénylalanine dans le pool plasmatique via la dégradation nette des protéines. Par conséquent, l’équation 3 prédit que ces patients atteints de PCU pourraient tolérer un apport de phénylalanine de 15 mg/kg par jour.
Calculé de la même manière, les patients atteints de « PCU modérée » avec une tolérance alimentaire de phénylalanine de 25 mg/kg par jour auraient besoin d’une activité PAH résiduelle égale à 15% de celle du type sauvage pour la métaboliser en 3.De même, les patients atteints de « PCU légère » ayant une tolérance alimentaire à la phénylalanine de 50 mg/kg par jour auraient besoin d’un niveau de HAP résiduel de 25 % du niveau de type sauvage pour métaboliser la phénylalanine ajoutée en environ 3.Ces résultats indiquent que l’équation 3 peut expliquer la tolérance à la phénylalanine alimentaire observée dans ces différents groupes de patients.
Il serait utile d’essayer de corréler ces estimations de l’activité PAH résiduelle pour les patients atteints de « PCU légère » et de « PCU modérée » avec l’activité hydroxylase résiduelle mesurée in vitro pour les espèces PAH mutantes hébergées par les patients. Cependant, à l’heure actuelle, une telle tentative est entravée par une trop grande dispersion des données in vitro. Ainsi, il a été démontré que plusieurs patients classés comme ayant une « PCU modérée » (42) abritent les trois formes mutantes suivantes de PAH (avec leurs activités PAH résiduelles in vitro exprimées en pourcentage des activités de type sauvage, indiquées entre parenthèses) : L348V (25%), R261Q (30%, 47%), et R158Q (10%) (43). On peut voir que ces valeurs varient de près de 5 fois. Comme discuté précédemment (2, 43), en général, les estimations in vitro de l’activité hydoxylase résiduelle des mutants de l’HAP ont tendance à être plus élevées que celles observées dans les biopsies du foie. Au moins une des raisons de cette tendance est que les activités des HAP in vitro sont habituellement mesurées en utilisant des concentrations saturantes de phénylalanine et de BH4, comme cela a été fait pour le mutant R261Q (44). Compte tenu de cette situation, il est possible que les activités résiduelles de l’HAP estimées à l’aide de l’équation 3 reflètent mieux les activités in vivo que celles mesurées in vitro.
Le présent modèle du métabolisme de la phénylalanine est pertinent pour la conclusion à laquelle sont parvenus Thompson et ses collègues (45, 46), sur la base des résultats obtenus par perfusion de sujets avec de la phénylalanine et de la tyrosine marquées au deutérium, que les patients atteints de PCU classique ont une activité de l’HAP « substantielle » qui est égale à environ 76% de celle des sujets témoins. Cette activité d’hydroxylation de la phénylalanine étonnamment élevée a été attribuée à la tyrosine hydroxylase (45). Comme nous l’avons déjà dit, les résultats résumés dans la figure 2 montrent qu’en l’absence d’HAP, une dose de phénylalanine est éliminée du sang à moins de 3 % du taux observé chez les témoins. Rien n’indique, d’après la présente analyse, qu’il existe chez l’homme une autre voie permettant d’éliminer de grandes quantités de phénylalanine. Récemment, van Spronsen et al. (34) ont signalé un problème méthodologique potentiel avec la méthode utilisée par Thompson et ses collègues.
En résumé, les résultats quantitatifs obtenus avec le modèle pour le métabolisme de l’HAP sont cohérents avec les données qui reflètent indirectement l’activité in vivo de l’HAP, telles que les niveaux de phénylalanine dans le sang à l’état d’équilibre, les taux de clairance (conventionnellement exprimés en valeurs t1/2) de la phénylalanine dans le sang après une charge de phénylalanine, et la tolérance alimentaire pour la phénylalanine. Le modèle permet d’estimer quantitativement l’activité résiduelle des HAP à partir de n’importe laquelle de ces valeurs, en particulier à partir des taux mesurés d’élimination d’une charge de phénylalanine. Les niveaux de HAP résiduels prédits ou les valeurs qui en sont dérivées peuvent être utiles pour décider de la rigueur de la restriction alimentaire de la phénylalanine pour atteindre le niveau de phénylalanine sanguin souhaité. Le tableau 1 résume les valeurs de t1/2 et les taux sanguins de phénylalanine à l’état d’équilibre calculés à partir de l’équation 3 (en supposant qu’il n’y ait pas d’apport de phénylalanine pendant la période d’essai) pour différents niveaux d’activité résiduelle de l’HAP, ainsi que des valeurs comparables provenant de données cliniques pertinentes.
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Niveaux sanguins de phénylalanine à l’état stable et valeurs t
pour la clairance de la phénylalnine calculées à partir de l’équation. 3 pour différents niveaux de HAP
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ABBREVIATIONS
PAH, phénylalanine hydroxylase ; PKU, phénylcétonurie ; HPA, hyperphénylalaninémie ; PAG, phénylacétylglutamine