Résultats et discussion
Deux voies d’oxydation du Pt chez E. coli. Des études génétiques ont montré que l’enzyme C-P lyase, codée par l’opéron phn, est capable d’oxyder le Pt (26). Cependant, dans une étude récente (9), nous avons été surpris d’observer que certains mutants phn de E. coli restaient capables d’oxyder le Pt. L’examen du génotype de ces souches a suggéré que le locus phoA pourrait être impliqué dans l’oxydation du Pt. Pour tester cette hypothèse directement, nous avons examiné les souches d’E. coli qui diffèrent uniquement dans les loci phn et phoA pour leur capacité à oxyder le Pt, comme démontré par leur capacité à croître sur des milieux avec du Pt comme seule source de P. Le phosphate étant nécessaire à la croissance, les organismes ne peuvent se développer sur ce milieu que s’ils ont la capacité d’oxyder le Pt en phosphate. Les souches qui étaient soit phoA + soit phn + se sont développées sur le milieu Pt (que l’autre locus soit muté ou non), alors que les souches avec des mutations à la fois dans phn et phoA ne l’ont pas fait (Fig. 1). Par conséquent, E. coli possède deux voies pour l’oxydation du Pt : une qui est dépendante de phn et une qui est dépendante de phoA.
A l’appui de cette hypothèse, nous avons détecté une production d’H2 dépendante du Pt à la fois in vitro et in vivo. Les essais in vitro ont été réalisés en aérobiose dans des flacons scellés en utilisant de la PAB hautement purifiée. Après incubation, l’espace de tête a été analysé pour le H2, et la portion aqueuse a été analysée pour le phosphate. Comme le montre la figure 2B , des quantités stœchiométriques de phosphate et de H2 ont été produites à partir de Pt en présence de BAP, alors que ni phosphate ni H2 n’ont été produits dans les réactions témoins contenant soit du BAP, soit du Pt seul.
Les produits de l’oxydation du Pt catalysée par la phosphatase alcaline osseuse sont le phosphate et l’H2 moléculaire.(A) Les spectres de résonance magnétique nucléaire 31P découplés en proton et les positions des pics sont indiqués pour les témoins Pt 5 mM et phosphate 5 mM, ainsi que pour une réaction d’une nuit qui contenait initialement 5 mM de Pt plus 500 μg de phosphatase alcaline osseuse purifiée. Un pic pour le Pt non réagi et un nouveau pic de phosphate sont évidents dans le spectre de la réaction enzymatique, mais aucun autre produit n’a été produit. Le léger décalage de la position du pic de phosphate entre le témoin et le produit de la réaction catalysée par la phosphatase alcaline osseuse est dû à des différences mineures de pH : l’ajout d’une solution mère de phosphate au dosage a augmenté la hauteur du pic de Pi mais n’a pas produit de pics supplémentaires. Les spectres couplés au proton sont tout à fait cohérents avec cette interprétation (données non présentées). (B) L’oxydation du Pt catalysée par la phosphatase alcaline osseuse produit des quantités stoechiométriques de phosphate et de H2 moléculaire. Les réactions in vitro contenant les composants indiqués ont été incubées pendant une nuit à 37°C dans des flacons scellés. L’espace de tête a ensuite été analysé pour H2 par chromatographie en phase gazeuse avec détection par conductivité thermique, tandis que la phase aqueuse a été analysée pour le phosphate en utilisant le test du vert malachite. Les réactions (3 ml) ont été réalisées dans 50 mM Mops (pH 7,0) avec 50 mM Pt (pH 7,0) et 387 μg de BAP purifiée, comme indiqué. Des contrôles triples contenant soit de la BAP soit du Pt seul ont été réalisés, mais ni le phosphate ni l’H2 n’ont été détectés dans ces conditions. Les résultats in vivo montrent la quantité d’H2 produite pendant la croissance de WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) dans un bouillon glucose/Mops à 0,4 % contenant 2,5 μmol de la source de P indiquée. Comme ce niveau de P (500 μM) est limitant pour la croissance, la source de P est censée être complètement assimilée lorsque les cultures atteignent la saturation. Après une nuit de croissance à 37°C dans des flacons scellés, l’espace de tête a été analysé pour H2 par chromatographie en phase gazeuse avec détection par conductivité thermique. Les expériences in vitro et in vivo ont été menées en aérobiose (c’est-à-dire que de l’O2 était présent pendant l’oxydation du Pt).
La mesure de l’H2 in vivo est compliquée par le fait que E. coli possède de multiples hydrogénases qui peuvent à la fois produire et consommer de l’H2. Pour contourner ce problème, nous avons construit un mutant ΔhypABCDE, qui ne peut produire aucune hydrogénase active en raison de son incapacité à faire mûrir les protéines précurseurs (32). Le mutant hyp, cultivé en aérobie dans des tubes scellés, a également produit des quantités à peu près stœchiométriques de H2 dans des cultures cultivées avec des niveaux de Pt limitant la croissance, alors qu’aucun H2 n’a été détecté dans des cultures cultivées avec des niveaux limitants de phosphate ou de l’ester de phosphate phosphosérine (Fig. 2B ).
L’oxydation du Pt n’est pas une caractéristique commune à toutes les phosphatases alcalines. L’oxydation efficace de Pt semble être une caractéristique unique de la phosphatase alcaline de E. coli. Ni Bacillus subtilis, qui est connu pour produire de multiples phosphatases très actives (33), ni P. stutzeri, qui est connu pour produire une phosphatase distincte de BAP (dans les souches qui manquent le système de déshydrogénase de Pt) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson, et W.W.M., données non publiées), peut utiliser Pt comme source unique de P (Fig. 3A ), bien que les deux organismes se développent sur les milieux avec la phosphosérine comme source unique de P (données non montrées). Ainsi, les phosphatases produites par ces organismes sont incapables d’oxyder le Pt à des taux qui sont suffisants pour soutenir la croissance. Nous avons également testé des préparations commerciales de phosphatase intestinale de veau (CIP) et de phosphatase alcaline de crevette (SAP) pour leur capacité à produire du phosphate à partir de Pt (Fig. 3B). Bien que de petites quantités de phosphate aient été produites par les phosphatases eucaryotes après une incubation d’une nuit, seule la BAP d’E. coli a pu catalyser la réaction à des taux significatifs. Ce résultat est particulièrement surprenant car les enzymes eucaryotes sont en fait de bien meilleures phosphatases, avec des activités spécifiques jusqu’à 40 fois supérieures à celles de la phosphatase alcaline osseuse (27). Ces enzymes partagent toutes une homologie significative (25-35% d’identité) avec la BAP d’E. coli ; de plus, la plupart des résidus du site actif, y compris Ser-102 (qui forme un intermédiaire phospho-enzyme covalent pendant la réaction de phosphatase), sont conservés (27).
L’oxydation du Pt est unique à la phosphatase alcaline de E. coli. (A) La capacité de B. subtilis et P. stutzeri à oxyder le Pt, comme démontré par la croissance sur des milieux avec Pt comme seule source de P, a été testée, comme décrit dans la Fig. 1. Aucun des organismes ne s’est développé sur le milieu Pt, alors que les deux organismes se sont développés sur le milieu phosphate. Ainsi, malgré le fait que les deux organismes ont des phosphatases actives, aucun ne peut oxyder le Pt à des taux suffisants pour soutenir la croissance. Le P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) contient des mutations qui éliminent les deux voies d’oxydation du Pt caractérisées de cet organisme mais qui n’affectent pas l’expression des phosphatases (9, 10). (B) La BAP (phosphatase alcaline d’E. coli), la SAP (phosphatase alcaline de crevette ; Roche Applied Science, Mannheim, Allemagne) et la CIP (phosphatase intestinale de veau ; Sigma) ont été testées pour l’oxydation du Pt comme décrit ci-dessus. Nous avons utilisé 56 μg de la phosphatase indiquée dans chaque essai, ce qui correspond à 3 unités de phosphatase BAP, 32 SAP et 65 CIP, mesurées par hydrolyse de la pNPP. Malgré les activités phosphatases beaucoup plus élevées des enzymes eucaryotes, seule la BAP a catalysé l’oxydation du Pt à des taux significatifs. La moyenne de deux essais est tracée.
Il semble plausible que l’oxydation du Pt soit catalysée par la BAP par un mécanisme similaire à celui utilisé pour l’hydrolyse des esters de phosphate (Fig. 4A ). Par conséquent, le Pt peut être hydrolysé par la phosphatase alcaline osseuse avec l’anion hydrure comme groupe partant formel. À l’appui de cette idée, un mutant de phoA dont le résidu Ser-102 du site actif a été changé en alanine est incapable d’utiliser le Pt comme seule source de P, ce qui indique que cet acide aminé est nécessaire à l’hydrolyse des esters de phosphate (27) et à l’oxydation du Pt (Fig. 4B). Bien que le transfert direct d’hydrure d’un substrat vers un proton aqueux soit biochimiquement sans précédent, cette réaction est thermodynamiquement raisonnable étant donné le fort potentiel réducteur du couple phosphate-Pt (E o′ = -0,650 V). Ainsi, la réaction de production de H assez favorable : ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (calculé à partir des potentiels redox dans la réf. 34). Si le modèle hydrolytique de l’oxydation du Pt s’avère correct, il s’agirait d’une réaction enzymatique très inhabituelle. Des études ont montré que la BAP est également capable d’hydrolyser les phosphodiesters (35), les phosphoamides (36), les esters de sulfate (37) et le thiophosphate (38). Cependant, ces réactions se produisent à des vitesses considérablement plus lentes que celle de la réaction d’hydrolyse du Pt, malgré le fait qu’elles impliquent des groupes partants bien meilleurs. De plus, ce ne sont pas des réactions d’oxydoréduction. La réaction analogue impliquant l’hydrolyse des acides alkylphosphoniques n’est pas catalysée par le PAB, comme le montrent à la fois la biochimie (39) et l’incapacité des souches Δphn à utiliser ces composés comme seules sources de P (13).
L’oxydation du Pt par le BAP peut se produire au moyen d’une hydrolyse avec l’anion hydrure comme groupe partant. (A) Le mécanisme chimique de l’hydrolyse de l’ester phosphate par la BAP implique une attaque nucléophile par un résidu sérine activé (Ser-102) sur l’ester phosphate pour former un intermédiaire enzymatique phosphosérine. Le groupe partant alkoxyde acquiert rapidement un proton de la solution pour former l’alcool correspondant. Il semble probable que l’oxydation du Pt se produise au moyen d’un mécanisme similaire avec l’anion hydrure comme groupe partant. (B) Le rôle de Ser-102 dans l’oxydation du Pt a été testé en examinant si un mutant portant une mutation Ser-102-Ala dans le gène phoA pouvait croître sur un milieu Pt, comme décrit dans la Fig. 1. Le mutant n’a pas réussi à se développer sur le milieu Pt, ce qui démontre la nécessité du site actif Ser-102 dans l’oxydation du Pt. La souche hôte était BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 et WM3611 portent des intégrants à copie unique des plasmides pKY1 et pKY2, qui codent respectivement le gène phoA de type sauvage (phoA+) ou le mutant phoA-S102A (Ser-102-Ala).
La Pt déshydrogénase (PtxD) avait été la seule enzyme caractérisée in vitro montrée pour catalyser l’oxydation du Pt (11). Bien que les détails de la réaction BAP restent à élucider, les mécanismes chimiques des deux enzymes sont clairement distincts. Alors que la PtxD nécessite le NAD comme accepteur d’électrons pour la réaction d’oxydoréduction, la réaction catalysée par la BAP ne nécessite aucun accepteur d’électrons exogène mais exploite la grande force motrice thermodynamique de la réaction pour produire un produit hautement réduit (H2) à partir de l’eau dans une réaction essentiellement irréversible (K eq calculé = 1,1 × 108). Toutes les autres réactions connues produisant du H2 fonctionnent beaucoup plus près de l’équilibre chimique et sont généralement réversibles. De plus, toutes les autres hydrogénases connues contiennent soit du Fe, soit du Ni, soit les deux, dans leurs sites actifs (40). Cette observation inclut la méthylène tétrahydrométhanoptérine déshydrogénase des archées méthanogènes, dite » sans métal « , qui forme du H2 et dont on sait maintenant qu’elle contient aussi du Fe (41). En revanche, la phosphatase alcaline osseuse ne contient pas de métaux redox actifs, bien que le Zn et le Mg soient nécessaires à l’activité hydrolytique (27). Le traitement de la BAP avec des chélateurs inhibe l’oxydation du Pt, ce qui suggère que les métaux jouent un rôle dans la réaction du Pt (données non présentées).
Enfin, les données in vivo présentées ici suggèrent que la réaction d’oxydation du Pt est biologiquement pertinente. L’observation que de nombreuses bactéries possèdent des enzymes dédiées à l’oxydation du Pt démontre que ce trait est sous une forte pression sélective dans les populations microbiennes (4, 5, 9, 42). En gardant ce fait à l’esprit, il est intéressant de noter que bien que les enzymes eucaryotes soient de bien meilleures phosphatases, elles sont incapables d’oxyder le Pt. Cette observation soulève la possibilité que la BAP d’E. coli n’ait pas évolué pour être la phosphatase la plus efficace, mais plutôt pour être une phosphatase ayant la capacité d’hydrolyser le Pt. Cette idée est cohérente avec l’observation curieuse que la BAP d’E. coli est très fortement exprimée (jusqu’à 6 % de la protéine cellulaire totale) dans des conditions de privation de phosphate (28). L’explication traditionnelle de ce phénomène est qu’un substrat inconnu de la phosphatase alcaline osseuse doit être mal hydrolysé et, par conséquent, nécessiter des quantités massives d’enzyme pour soutenir des taux de croissance compétitifs. Cependant, comme il y a peu de différence dans les taux d’hydrolyse mesurés pour une grande variété de substrats d’esters de phosphate (39, 43), il semble peu probable que ce substrat pauvre puisse être un ester de phosphate. En revanche, le taux d’hydrolyse du Pt est sensiblement inférieur au taux d’hydrolyse de l’ester de phosphate, ce qui suggère que le Pt pourrait être le substrat qui explique le niveau extrême d’expression de la phoA observé dans E. coli privé de phosphate.
Il est clair que de nombreux détails de la réaction de la phosphatase alcaline osseuse avec le Pt restent à élucider. Une étude plus approfondie de cette réaction unique est susceptible de contribuer non seulement à notre compréhension de la chimie redox du P et des réactions de transfert de phosphoryle, mais aussi à notre connaissance du transfert d’hydrure, des réactions produisant de l’H2, et du rôle des composés P réduits dans la nature.