Abstract
A jelen munkában a dél-amerikai harcsa, Rhamdia quelen hasnyálmirigy-szigetei szekretoros sejtjei ultrastruktúrájának részletes leírását mutatjuk be. Bizonyítékokat nyújtunk annak alátámasztására, hogy az α-granulumok egy központi és egy külső, különböző elektronsűrűségű és oldhatóságú részből állnak, hogy a δ-sejtek valószínűleg morfológiailag megváltozott, de életképes α-sejtek, és hogy a β-granulumok valószínűleg ismétlődő alstruktúrával rendelkeznek, és ezért az inzulin intracelluláris kristályos tárolási formáját képviselhetik.
1. Bevezetés
A Langerhans-szigeteket Langerhans fedezte fel a nyúlban 1869-ben. Stannius és Blockmann azonban már mintegy 20 évvel korábban beszámolt róluk teleosztákban, ezért – bár ritkábban – Stannius vagy Blockmann-testek néven is emlegetik őket. A Langerhans-szigetek endodermális eredetűek, és a legtöbb teleosztrikusban a hasnyálmirigy exokrin részében elszórtan elhelyezkedő kis testek.
A halaknak nincs különálló hasnyálmirigye. Az exokrin hasnyálmirigyszövet a bélcsatorna mentén elszórtan található. Az exokrin hasnyálmirigy acináris szerkezete nagyon hasonlít az emlősökéhez, és nagyon sötét, bazofil citoplazmájú sejtekből áll . Az aktívan táplálkozó halakban nagyszámú világos eozinofil, szekréciós szemcséket tartalmaznak. Az endokrin hasnyálmirigy Langerhans-szigetét meg lehetett különböztetni, és a szövet α-sejteket (glükagonszerű peptidet termelő), β-sejteket (inzulint termelő) és d-sejteket (szomatosztatint termelő) tartalmaz. Az emlősök és az emberek esetében a felnőtt emberi hasnyálmirigy-szigetsejtek legtöbb korábbi elektronmikroszkópos leírása rövid volt, és a publikációk kisebb részét elsősorban a β-sejtes daganatok leírásának vagy a több faj szigetsejtjeinek összehasonlító morfológiáját tárgyaló áttekintő cikkeknek szentelték .
A halak hasnyálmirigye nem gyakran bizonyul kész szövetforrásnak az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz. A halak fő hasnyálmirigye anatómiailag és fejlődési szempontból is hasonlít az emlősök hasnyálmirigyéhez, míg más halfajoknál jelentős különbségek mutatkoznak. A kifejlett zebrahalakban a fő hasnyálmirigy több fő szigetet tartalmaz, amelyeket exokrin szövet vesz körül. Az exokrin szövetbe és zsírba ágyazott egyes szigetekből álló farok a bél mentén, caudálisan húzódik. Ezzel szemben a tilápia (egy másik glükózérzékeny teleosthal) β-sejtjei Langerhans-szigeteiben találhatók, amelyek a bélcsatorna mentén helyezkednek el, és nincsenek exokrin szövetekkel körülvéve. A Rhamdia quelen egy teleost faj, és fontos faj a szubtrópusi éghajlatú akvakultúrákban. A R. quelen Mexikó déli részétől Argentína középső részéig megtalálható, és a faj tenyésztése egyre inkább Brazília déli része felé terjed .
A jelen tanulmányban elemezzük a Langerhans-szigetek ultrastruktúráját és részletesen leírjuk a különböző típusú szekréciós sejteket a dél-amerikai harcsák R. quelen.
2. Anyagok és módszerek
Négy tenyésztett R. quelem két nőstény és két hím ( g; cm) az Argentína északkeleti régiójában található Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) tenyészetből származik, és 200 literes medencékbe telepítették őket, ahol a boncolás előtt két hétig akklimatizálták őket. A halakat 25 °C-on tartott szűrt édesvízben nevelték, napi 100%-os vízcsere mellett. A fotoperiódust 12 óra sötétre és 12 óra világosra állítottuk be. Naponta négyszer kézzel etettük őket kereskedelmi táppal (Ganave). A halakat benzokainnal (500 ppm) elaltattuk és nekropsziáztuk, majd a bél mentén caudalisan elhelyezkedő zsírmintákat 10%-os pufferelt formalinban rögzítettük, paraffinba ágyaztuk és hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük.
A szövetek kisebb darabjait 1 mm-es blokkokra vágtuk és azonnal foszfátpufferes glutaraldehidben rögzítettük (pH 6).9 4°C-on), Millonig-oldatban mostuk, majd 1%-os ozmiumtetroxidban posztfixáltuk; a szövetblokkokat ezután etanol-aceton fokozatos sorozatában dehidratáltuk, propilén-oxidba merítettük, és Durcupan ACNI-be ágyaztuk (Fluka Chemie A.G., Svájc). A vékony metszeteket LKB ultramikrotómával vágtuk, majd uranil-acetáttal és ólom-citráttal kétszeresen festettük, mielőtt Jeol JEM-8T elektronmikroszkópban (Jeol, Tokió, Japán) vizsgáltuk.
3. Eredmények
3.1. Fénymikroszkópia
R. quelen hasnyálmirigyei elszórtan helyezkednek el a közös epevezetéket körülvevő zsírszövetben; ez egy nagyjából háromszög alakú területen belül helyezkedik el, amelyet feljebb a gyomor, elöl a máj, lejjebb pedig a lép és az epehólyag határol. Minden Langerhans-sziget viszonylag tiszta szigetszövetből áll, amelyet exokrin hasnyálmirigy vesz körül (1. ábra). A hímek és nőstények között nem észleltünk különbséget.
3.2. H&E. X 10). Elektronmikroszkópia
A β-sejteket, amelyek általában a szigetek belsejét foglalják el, általában, de nem mindig a periférián elhelyezkedő α-sejtek választották el az exokrin hasnyálmirigytől (2. ábra). A β-sejtek ultrastrukturális megjelenése azonos volt a négy halból nyert mintákban. A jellegzetes β-granulákat sima hártyájú zsákok tartalmazták, méretük és alakjuk változó volt. Négyszögletes, négyzet alakú, hatszögletű és szabálytalanul sokszögletű kristályok voltak láthatók. A kerek formák is jelen voltak, de ritkábban (2-5. ábra). Minden szemcse egy vagy több, változó méretű és alakú kristályos vagy strukturálatlan formából állt. Úgy tűnt, hogy a fixálószer megválasztása nem befolyásolja a β szemcsék belső szerkezetét. A burkolómembrán határain belül a kristályok perifériáján lévő terület üresnek tűnt, vagy finom flokkulens csapadékot tartalmazott, függetlenül az alkalmazott fixálószertől. Nagyobb nagyításnál néha ismétlődő alstruktúra volt látható azokban a kristályokban, amelyek a metszet síkjához képest megfelelően orientáltak (6. és 7. ábra). A számos mitokondrium eloszlott a sejtben, és gömbölyded vagy pufók fonalas struktúrákként jelent meg. Nagyobbak és számosabbak voltak, mint a β-sejteké, de általában kisebbek, mint a hasnyálmirigy acináris sejteké. A számos mitokondriális cristae többnyire keresztirányban helyezkedett el, és a mitokondriális granulumok jelen voltak, de nem kiemelkedőek. A granuláris endoplazmatikus retikulum ciszternái általában rövidek vagy hólyagosak voltak (2-4. ábra). A granuláris endoplazmatikus retikulum és a szabad riboszómák nem voltak olyan feltűnő jellemzői a β-sejteknek, mint az acináris vagy a β-sejteknek. Azok a kevés szekréciós szemcsével rendelkező β-sejtek általában gazdagabban voltak ellátva riboszómákkal és granuláris endoplazmatikus retikulummal, amely ekkor gyakrabban volt ciszternális konfigurációjú (5. ábra).
A Golgi-komplex az aldehidfixálás után markánsabb volt, és a komponens struktúrák jobban kitágultak (2. ábra). E fixálószerek alkalmazása után a Golgi-vezikulákon belül esetenként sűrű amorf anyag volt látható, amely éretlen szemcséket vagy a β-szekretoros szemcsék előfutárait jelentheti. A β-sejtmagok általában gömb alakúak és viszonylag sima kontúrúak voltak. A szomszédos szigetsejtek sejtmembránja szorosan illeszkedett a deszmoszómákhoz, bár gyakran nem csatlakoztak hozzájuk. Három vagy több sejt találkozásánál a határmembránok gyakran tekervényesek voltak, és a sejtek között kanyargós átkötések voltak (2. és 9. ábra). A legtöbb β-sejtben szembetűnőek voltak a ceroidra emlékeztető multivesikuláris citoplazmatikus zárványok (2., 7., 9. és 8. ábra). E zárványok megjelenését és gyakoriságát nem befolyásolta jelentősen az ozmás sav vagy az aldehid elsődleges használata fixálószerként, és nem volt nyilvánvaló kapcsolat e szemcsék jelenléte és a sejtek fiziológiás aktivitásának morfológiai bizonyítékai között. Az α-sejtek ultrastruktúrája mind a négy szövetmintában azonos volt. E sejtek és sejtmagjaik mérete és alakja nem különbözött jelentősen a normál β-sejtekétől (2. és 7. ábra). Bár alkalmanként találtunk olyan α-sejtet, amelynek sejtmagja szabálytalan alakú vagy behorpadt volt, ez nem fordult elő elég gyakran ahhoz, hogy hasznos megkülönböztető kritériumként szolgáljon. Az α-sejtek citoplazmás szemcséit az elsődleges ozmium-fixálás sűrű, gömb alakú, változó méretű testekként őrizte meg, és lazán illeszkedő, sima hártyájú zsákokban voltak (7. és 9. ábra). Ezek nagyobbak voltak, mint a β-granulumok, de lényegesen kisebbek, mint az acinuszsejtek zimogén-granulumai (2. ábra). A karcsú, hosszúkás mitokondriumok száma mérsékelt volt, kisebbek voltak, mint a β-sejteké, és általában keresztirányban elhelyezkedő cristákkal rendelkeztek. A szemcsés endoplazmatikus retikulum gyakran cisztás elrendezésű volt, és nagyobb mennyiségben volt jelen, mint a β-sejtekben (9. ábra). A Golgi-komplexum, ha látható volt, mérsékelt arányú volt. A Golgi-vezikulákon és ciszternákon belüli sűrű amorf anyagok, amelyek feltehetően a szekréciós granulumok előfutárai, az α-sejtekben gyakoribbak voltak, mint a β-sejtekben (10. ábra). A ceroidtestek, bár gyakran láthatóak voltak, ritkábban fordultak elő, mint a β-sejtekben (2. és 3. ábra). A zsákok, amelyekben az α-granulumok helyezkednek el, tehát teljesen kitöltöttnek tűntek, és arra a következtetésre jutottunk, hogy a granulumok egy lekerekített belső sűrű magból és egy külső, kevésbé elektronsűrű köpenyből állnak, amely az ozmium-fixálás után hiányzott (3. és 9. ábra), és ezért talán jobban oldódik. Sem az α-granulumok belső, sem a perifériás részein belül nem volt látható következetes szubstruktúra. Semmikor sem láttunk olyan sejteket, amelyeket az α-sejtek és a β-sejtek közötti átmeneti formaként lehetett volna értelmezni. Az α-szemcsék, beleértve mind a külső, mind a belső, sűrűbb részeket, összméretükben hasonlóak voltak a “δ-szemcsékhez”. Sőt, olyan köztes sejtek is jelen vannak, amelyek mindkét típusú granulumot tartalmazták, ami arra utal, hogy a δ-sejtek valójában módosított α-sejtek voltak (10. ábra). A δ-sejtek láthatóvá váltak, bár szinte mindig az α-sejtek között helyezkedtek el, és az alacsonyabb elektronsűrűség és a szekréciós szemcsék nagyobb összmérete alapján azonosították és ultrastrukturálisan megkülönböztették őket az α-sejtektől. Ezen túlmenően köztes sejtek is jelen vannak, amelyek mindkét típus granulumait tartalmazzák, ami arra utal, hogy a δ-sejtek valójában módosított α-sejtek voltak (11. ábra).
Bár fordított kapcsolat állt fenn a szekréciós granulumok száma és a Golgi-komplex és a granuláris endoplazmatikus retikulum kiemelkedése között, az α- vagy β-granulumok felszabadulásának mintázata nem volt megfigyelhető. A hasnyálmirigy-szigeteket általában vékony bazálmembrán és különböző mennyiségű kötőszövet választotta el a szomszédos acináris sejtektől (2. ábra). Esetenként azonban nem volt bazális membrán a szigetek és az acináris sejtek között, amelyeket ekkor csak a keskeny intersticiális tér választott el egymástól. A fenesztrált kapilláris endotélsejteket mindig legalább a kapilláris bazális membrán választotta el tőlük (9. ábra). Néha egyéb támasztó elemek is jelen voltak, beleértve a kollagént és az elasztikus szöveti komponenseket. A hímek és nőstények között nem figyeltek meg különbséget.
4. Megbeszélés
A halak β-sejtjei a szekréciós granulumok morfológiája alapján könnyen megkülönböztethetők az α-sejtektől. A szögletes alegységek gyakori jelenléte és a nyilvánvalóan ismétlődő alstruktúra a β-granulumok kristályos jellegére utal. A kristályrács felbontására és méreteinek mérésére tett kísérletek még nem jártak sikerrel. Amikor a szekréciós szemcséket a Golgi-komplexum közelében vizualizálták, általában nem figyeltek meg kristályos alegységeket. Ezért csábító a feltételezés, hogy a nem kristályos szemcsék vagy a Golgi-komplexumon belüli amorf anyag az inzulin vagy az inzulinfehérje-komplex más kémiai vagy fizikai formáját képviseli, mint a szemcsék kristályos alegységei. Nem ismert, hogy ezek a különböző morfológiai formák a β-granulákon belül rendelkeznek-e különböző oldhatósággal és talán különböző mintázattal, vagy a fiziológiai igényre adott válaszként történő felszabadulással. A granuláris endoplazmatikus retikulum ciszternáiban vagy vezikuláiban nem figyeltek meg szekretoros granulákat. Feltételezhető, hogy más fehérjeszekretáló sejtekhez hasonlóan a Golgi-komplexum a granuláris endoplazmatikus retikulumban szintetizált termék koncentrálására vagy “csomagolására” szolgál. Ebből logikusan következne, hogy a sima membrános zsákok, amelyekben a szekréciós szemcsék vannak, inkább a Golgi-membránokból származnak, mint a granuláris endoplazmatikus retikulumból.
Az α-sejtek nagy, kerek, sűrű szekréciós szemcséikkel meglehetősen hasonlítanak más fajok α-sejtjeihez. Bár az α-sejtek szemcséinek mérete széles skálán mozog, úgy tűnt, hogy a legtöbb sejt különböző méretű szemcsékkel rendelkezik, ami kizárja ennek a sejttípusnak az alosztályozását, ahogyan azt más fajok esetében javasolták. Jelenleg nem publikáltak olyan fiziológiai adatokat, amelyek alátámasztanák a “δ-sejt” létezését a halak hasnyálmirigy-szigetmirigyében. A különböző protagonisták a δ-sejtek létezését olyan adatokkal támasztották alá, amelyek fénymikroszkópos vizsgálatokon alapulnak a szeszfoszforsav-ezüst, foszforsav-hematoxilin és más szemcsés festékeken vagy rosszul konzervált szövetek elektronmikroszkópos vizsgálatain. Az itt bemutatott mikroszkópos felvételek alátámasztják a Bloom által 1931-ben, majd Gomori által 1941-ben vélt véleményt, miszerint a δ-sejtek módosított α-sejteket képviselhetnek.
A tipikus, belső sűrű és külső kevésbé sűrű részekkel rendelkező α-granulátumról a körülbelül azonos méretű, egyenletes, de csökkent sűrűségű δ-granulátumra való átmenetet gyakran a mitokondriumok, a Golgi-komplex és a granuláris endoplazmatikus retikulum membránkomponenseinek morfológiai integritásának vagy festődési intenzitásának fokozatos elvesztése kíséri. Az ép és életképesnek tűnő sejtmagok, valamint a kis számú szabad riboszómák és ceroidtestek fennmaradása arra utal, hogy az úgynevezett δ-sejtek még az átmenet feltételezett végstádiumában is életképesek, vagyis amikor maguk a szekréciós granulumok már nem láthatók, és a ceroidszemcséken és riboszómákon kívül minden citoplazmatikus organellum hiányzik. A δ-sejteknek funkciót tulajdonító fiziológiai adatok és a különálló sejttípusra vonatkozó meggyőzőbb morfológiai bizonyítékok hiányában reméljük, hogy az α-sejtekből a δ-sejtekbe való valószínű átmenet itt bemutatott leírását az emberi Bloom harmadik granuláris sejtjének legvalószínűbb magyarázataként fogadják el. Ezeknek az életképes, de megváltozott α-sejteknek a jelentősége nem ismert. Bár α- és β-sejtek egyesével vagy kis csoportokban láthatók az acinusokban és a csatornákban, a vizsgált négy hasnyálmirigyminta egyikében sem láttak köztes formákat az acinus és a szigetsejtek, illetve a csatornák és a szigetsejtek között, ahogyan azt Nakamura és Yokote (4) javasolta.
Érdekütközés
A szerzők kijelentik, hogy e cikk publikálásával kapcsolatban nem áll fenn érdekellentét.
Köszönet
L. A. Romano termelékenységi kutatási ösztöndíjat kapott a Brazil Kutatási Tanácstól, CNPq (Process no. PQ 301002/2012-6).